HPV16 E7癌基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞系的建立及其對(duì)HLA-Ⅰ類分子表達(dá)的影響.pdf

1、目的: 通過真核表達(dá)載體pCMV-tag2B將HPVl6 E7基因?qū)肴擞郎砥ぜ?xì)胞HaCaT，建立穩(wěn)定表達(dá)HPVl6E7的HaCaT-E7細(xì)胞系，探討HPVl6E7癌基因?qū)LA-I類分子表達(dá)的影響及相關(guān)機(jī)制。 方法: 1.穩(wěn)定表達(dá)HPVl6 E7 HaCaT細(xì)胞系的建立取對(duì)數(shù)生長期的HaCaT細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染pCMV-E7、pCMV-tag2B質(zhì)粒及設(shè)立空白對(duì)照組。500ug/ml G418篩選21天后，空白

2、對(duì)照組的正常細(xì)胞全部死亡，轉(zhuǎn)染組挑選陽性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HPVl6 E7的細(xì)胞系HaCaT-E7及空載體對(duì)照細(xì)胞系HaCaT-pCMV。 2.HaCaT-E7細(xì)胞系的鑒定取對(duì)數(shù)生長期正常HaCaT細(xì)胞、HaCaT-E7細(xì)胞、HaCaT-pCMV細(xì)胞，TRIZOL法提取細(xì)胞總RNA，以O(shè)ligdT引物將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以管家基因β-actin為內(nèi)參照，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測HPVl6E7 mRNA的表達(dá)；分別提

3、取正常HaCaT細(xì)胞、HaCaT-E7細(xì)胞、HaCaT-pCMV細(xì)胞總蛋白，經(jīng)SDS-聚丙稀酰胺(SDS-PAGE)蛋白電泳，Western Blot檢測HPVl6E7蛋白的表達(dá)。 3.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞膜表面HLA-I類分子的表達(dá)取對(duì)數(shù)生長期正常HaCaT細(xì)胞、HaCaT-E7細(xì)胞、HaCaT-pCMV細(xì)胞，0.25％胰酶消化，含1％牛血清白蛋白的PBS(BSA，PBS-B)調(diào)整細(xì)胞濃度為107cells/ml。取100μ1細(xì)

4、胞懸液，加入20ul抗HLA-ABC-FITC或抗KLH-FITC(同型對(duì)照)，混勻后避光靜置20min，PBS-B沖洗兩遍，400μlPBS-B重懸，上機(jī)檢測。同理用抗CD46-FITC檢測細(xì)胞膜表面CD46，做為陽性對(duì)照。 4.兩步法實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測HLA-ImRNA的表達(dá)取對(duì)數(shù)生長期正常HaCaT細(xì)胞、HaCaT-E7細(xì)胞、HaCaT-pCMV細(xì)胞，TRIZOL法提取細(xì)胞總RNA，以O(shè)ligdT引物將RNA逆轉(zhuǎn)錄為c

5、DNA。以管家基因β-actin為內(nèi)參照，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測HLA-A、 HLA-B、HLA-C mRNA的表達(dá)。反應(yīng)結(jié)束得到各個(gè)基因的循環(huán)閾值(Ct值)，用相對(duì)定量的方法(2一△△cT)來分析各個(gè)基因mRNA表達(dá)的改變。 結(jié)果: 1.轉(zhuǎn)染HPVl6 E7后，500ug/ml G418篩選21天，出現(xiàn)單細(xì)胞克隆。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測HaCaT-E7組細(xì)胞HPVl6 E7 mRNA的表達(dá)，HPVl6 E7與內(nèi)參照β-

6、actin相差約13.27±0.86個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增片段約93bp，與HPVl6 E7目的片段相符。Western Blot結(jié)果顯示，HaCaT-E7組細(xì)胞在17KD處檢測到HPVl6 E7蛋白的表達(dá)，與Caski細(xì)胞系所表達(dá)的HPVl6E7位置一致，證實(shí)HPVl6 E7蛋白在HaCaT-E7細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，HaCaT-E7細(xì)胞系構(gòu)建成功。 2.流式細(xì)胞術(shù)檢測正常HaCaT組、HaCaT-pCMV組、

7、HaCaT-E7組細(xì)胞表面HLA-ABC：三組細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度依次為357.65±15.65、346.82±16.77、182.16±16.47。HaCaT-E7組比正常HaCaT組和HaCaT-pCMV組HLA-ABC的表達(dá)顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CD46分子表達(dá)于人類所有細(xì)胞膜表面，其在三組細(xì)胞中的表達(dá)差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明HPVl6 E7癌基因的導(dǎo)入對(duì)其它膜表面分子的表達(dá)沒有影響，HaCaT-E7組細(xì)胞HLA-ABC的下降是

8、特異性的。 3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測正常HaCaT組、HaCaT-pCMV組、HaCaT-E7組細(xì)胞HLA-A、B、C mRNA的表達(dá)： 2-ΔΔcT法計(jì)算出各個(gè)基因針對(duì)內(nèi)參照β-actin的相對(duì)表達(dá)量，A、B、C三個(gè)位點(diǎn)在HaCaT-E7組的表達(dá)與正常HaCaT組及HaCaT-pCMV組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HLA-A，P=0.954；HLA-B，P=0.78l；HLA-C.P=0.821)。 結(jié)論: 1