活化的肝星狀細胞誘導(dǎo)骨髓來源抑制性細胞擴增和遷移的機制研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球第五大常見的惡性腫瘤，在腫瘤致死的病因中排名第三位。在全球，每年有超過50萬人死于肝癌，且一半以上在中國。隨著科學研究的發(fā)展，科研人員發(fā)現(xiàn)肝癌的發(fā)生發(fā)展不僅僅是病毒感染、環(huán)境因素、基因突變這些因素，腫瘤微環(huán)境對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有著重要作用。肝臟是一個具有“免疫特赦”的臟器，肝癌微環(huán)境中的非實質(zhì)細胞及其細胞因子是肝癌的免疫逃逸，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要因素。

2、>　　肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSCs）是肝癌微環(huán)境中重要的非實質(zhì)細胞?；罨男菭罴毎哂忻庖哒{(diào)節(jié)能力，能夠誘導(dǎo)免疫抑制細胞的產(chǎn)生，促進肝癌的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。髓系來源抑制性細胞(myeloid-derived suppressor cell，MDSCs)是具有免疫負調(diào)控作用的免疫抑制細胞，是近年來研究的熱點。前期研究發(fā)現(xiàn)活化的星狀細胞能促進肝癌的發(fā)生發(fā)展，促進肝癌中MDSCs的蓄積。然而在活化的HS

3、Cs誘導(dǎo)MDSCs在肝癌微環(huán)境中蓄積的機制并不清楚。本文能過以下三個部分研究進行探討和闡述。
　　第一部分 髓系來源抑制性細胞及其亞群的分選
　　本章首先通過流式分選方法對比不同的流式抗體分選荷瘤小鼠骨髓中的MDSCs的可行性。我們單標APC-CD11b或PE-Gr-1或雙標APC-CD11b，PE-Gr-1，對比其分選后的細胞純度和細胞活力，發(fā)現(xiàn)三各方法分選得到的細胞90％以上為CD11b+Gr-1+的細胞，即MDSCs，

4、且其細胞活力都達95％以上。然而用CD11b單色標記分選MDSCs既可以滿足實驗對細胞純度和活力的要求，又重復(fù)性高，減少熒光素染料對后續(xù)實驗的干擾，同時也節(jié)省資源。
　　為了進一步研究MDSCs亞群，我們還建立不同的方法分選荷瘤小鼠脾臟中PMN-MDSCs和Mo-MDSCs。應(yīng)用流式和磁珠分選的方法都能得到高純度和高活力的PMN-MDSCs和Mo-MDSCs。而PMN-MDSCs在脾臟中比例較高，流式分選會更節(jié)省資源。而Mo-MD

5、SCs在脾臟中比例很少，則選用磁珠分選的方法可以更省時間。本部分研究提供了MDSCs及亞群的分選方法，為后續(xù)HSCs對MDSCs作用的機制研究奠定了基礎(chǔ)。
　　第二部分 活化的肝星狀細胞促進髓系來源抑制性細胞擴增的機制研究
　　在體外，HSCs條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)骨髓細胞向MDSCs分化，促進PMN-MDSCs和Mo-MDSCs的擴增。用COX2抑制劑處理HSCs和EP4抑制劑抑制骨髓細胞的PGE2受體， HSCs細胞的上清不能誘

6、導(dǎo)MDSCs及PMN-MDSCs的擴增，證明HSCs通過分泌PGE2/EP4誘導(dǎo)MDSCs及的擴增。在體內(nèi)小鼠肝癌模型中，我們用COX2抑制劑處理的HSCs與肝癌細胞共移植，HSCs促進腫瘤生長的能力減弱，HSCs誘導(dǎo)脾臟和腫瘤中的MDSCs及其亞群的能力均減弱。研究結(jié)果表明HSCs通過PGE2/EP4通路誘導(dǎo)MDSCs及其亞群的擴增，為肝癌的免疫治療提供新的理論基礎(chǔ)。本研究首次探討了肝癌微環(huán)境中HSCs與MDSCs及亞群的關(guān)系。

7、>　　第三部分 活化的肝星狀細胞促進髓系來源抑制性細胞遷移及其機制研究
　　本章通過用HSCs條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)荷瘤小鼠脾細胞遷移，證明了活化的肝星狀細胞對荷瘤小鼠脾臟細胞中MDSCs有顯著性的趨化作用，且HSCs條件培養(yǎng)基能顯著升高Mo-MDSCs的趨化能力。蛋白芯片分析HSCs條件培養(yǎng)基中趨化因子的表達情況，結(jié)果表明HSCs主要含有趨化因子CCL2，SDF-1，CXCL1，CXCL5。進一步分選PMN-MDSCs和Mo-MDSCs

8、用PCR基因芯片分析其趨化因子及受體的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CCL2的受體CCR2在Mo-MDSCs的表達比PMN-MDSCs高了515.5倍，而CXCL1，CXCL5的受體CXCR2則主要表達在PMN-MDSCs，SDF-1受體CXCR4在PMN-MDSCs和Mo-MDSCs上都高表達。進一步我們用分別這些趨化因子中和抗體和受體的拮抗劑處理HSCs條件培養(yǎng)基和MDSCs，結(jié)果表明只有SDF-1中和抗體和CXCR4拮抗劑能阻斷HSCs件培養(yǎng)