人顆粒溶素基因的cDNA克隆、表達(dá)與功能實驗.pdf

1、目的:克隆人顆粒溶素(granulysin)基因cDNA，構(gòu)建顆粒溶素原核表達(dá)載體并進(jìn)行表達(dá)，純化大腸埃希菌表達(dá)的谷胱苷肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)-顆粒溶素融合蛋白，并檢測其體外抗菌活性。 方法:1.用結(jié)核分枝桿菌抗原(Mtb-Ag)刺激人外周血單個核細(xì)胞(PBMC)，加IL-2擴增11d獲得Mtb-Ag激活的T細(xì)胞(MtbAT)細(xì)胞，收集細(xì)胞提取總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)從MtbAT細(xì)胞獲得顆粒溶素cD

2、NA，PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳、割膠回收后，克隆入載體pCDNAⅡ中，形成重組載體pCDNAⅡ-granulysin。篩選出陽性克隆，通過限制性內(nèi)切酶酶切鑒定后對其進(jìn)行測序。2.取測序正確的重組載體pCDNA Ⅱ-granulysin再克隆到原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX4T-1中，構(gòu)建重組表達(dá)載體pGEX4T-1-granulysin，篩選出陽性克隆后通過限制性內(nèi)切酶酶切鑒定。3.取pGEX4T-1-granulysin轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21，用I

3、PTG誘導(dǎo)GST-顆粒溶素融合蛋白表達(dá)，將誘導(dǎo)處理后的細(xì)菌破碎，并用SDS-PAGE鑒定，分離含有可溶性GST-顆粒溶素融合蛋白的細(xì)菌裂解液，并通過GSH-瓊脂糖珠親和層析柱純化。4.四甲基噻唑氮藍(lán)(MTT)法檢測該純化蛋白對大腸埃希菌BL21、金黃色葡萄球菌Cowan I株、甲型溶血性鏈球菌S34Sr株、傷寒沙門菌0901株抗菌活性。 結(jié)果:1.PBMC經(jīng)Mtb-Ag刺激，擴增獲得大量MtbAT細(xì)胞，其中γδT細(xì)胞占77.

4、62％。從MtbAT細(xì)胞總RNA中擴增得到438bp的目的片段。2.核苷酸序列分析顯示其cDNA序列與GenBank中顆粒溶素基因編碼序列基本相同，僅發(fā)現(xiàn)編碼119位氨基酸的ACC向ATC改變，其編碼的氨基酸由蘇氨酸(T)變成了異亮氨酸(I)。 3.含重組表達(dá)載體pGEX4T-1-granulysin的大腸埃希菌BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE顯示出一條相對分子量(Mr)為44kD的蛋白條帶，采用親和層析法可獲得分子量為44