芪術(shù)顆粒對(duì)肝纖維化形成過(guò)程中P38信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響.pdf

1、1理論研究部分
　　通過(guò)對(duì)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究進(jìn)展及中醫(yī)學(xué)對(duì)于肝纖維化研究概況的相關(guān)文獻(xiàn)資料的整理分析，同時(shí)結(jié)合本課題組前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討“化瘀通絡(luò)”法在防治肝纖維化中的具體機(jī)制，完善絡(luò)病論治肝纖維化的理論研究。
　　根據(jù)現(xiàn)代的解剖學(xué)知識(shí)，肝門(mén)靜脈、肝動(dòng)脈、肝靜脈均有逐級(jí)分支，肝竇作為通透性最大的血竇之一，是肝內(nèi)血管的終末分支，是保障血液和肝細(xì)胞間正常物質(zhì)交換的組織學(xué)基礎(chǔ)，具有參與物質(zhì)交換、能量交換、信息傳遞的功能。而根據(jù)

2、中醫(yī)理論，絡(luò)脈具有滲灌血?dú)?、互滲津血等獨(dú)特的生理功能，是經(jīng)脈中氣血營(yíng)養(yǎng)臟腑組織的橋梁和樞紐。因此，從肝竇和肝絡(luò)的結(jié)構(gòu)及功能特點(diǎn)來(lái)看，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的肝竇及其在肝纖維化過(guò)程中發(fā)生的毛細(xì)血管化改變可歸屬于中醫(yī)肝絡(luò)及其病變的重要組成部分。
　　2實(shí)驗(yàn)研究部分
　　目的：動(dòng)態(tài)觀察芪術(shù)顆粒對(duì)CCL4所致的肝纖維化形成過(guò)程中VEGF介導(dǎo)的p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響，進(jìn)一步闡釋芪術(shù)顆?？垢卫w維化的作用機(jī)理，完善從絡(luò)病論治肝纖維化的理論，為

3、“化瘀通絡(luò)法”提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：采用10％CCl4橄欖油腹腔注射建立大鼠肝纖維化模型，同時(shí)給予芪術(shù)顆粒灌胃預(yù)防，并設(shè)立正常對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、模型對(duì)照組，分別于造模的第1w、2w、4w時(shí)間點(diǎn)耿大鼠肝組織進(jìn)行以下觀察。1：于預(yù)定時(shí)間點(diǎn)切取100mg(<1cm×1cm)新鮮肝組織置于-80℃的液氮中保存，用Western blot免疫印跡法檢測(cè)大鼠肝臟組織中VEGF介導(dǎo)的總p38 MAPK及p-p38 MAPK、總ATF-2及

4、p-ATF-2蛋白的表達(dá)量。2：耿肝組織1mm3，迅速置于4℃2.5％的戊二醛固定。經(jīng)過(guò)鋨酸、梯度丙酮、環(huán)氧樹(shù)脂及醋酸鈾.檸檬酸鉛等固定、包埋、染色。切片。透射電鏡觀察并照相，對(duì)肝竇竇壁結(jié)構(gòu)、肝竇內(nèi)皮窗孔數(shù)目、內(nèi)皮下基底膜的形成進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察。
　　結(jié)果：
　　1.大鼠肝組織總p38 MAPK蛋白表達(dá)的影響
　　各組大鼠肝組織在1周、2周和4周時(shí)間點(diǎn)，總p38 MAPK的蛋白表達(dá)量均較強(qiáng)，顯示較濃。
　　1周時(shí)，模

5、型對(duì)照組、芪術(shù)顆粒組與正常組比較有差異(1.75±0.25vs1.13±0.28，1.68±0.26vs1.13±0.28；p<0.05)；2周時(shí)，模型對(duì)照組、芪術(shù)顆粒組與正常組比較無(wú)差異(1.56±0.44vs1.22±0.26，1.38±0.24vs1.22±0.26；p>0.05)；4周時(shí)，模型對(duì)照組與正常組、實(shí)驗(yàn)組比較有顯著差異(1.83±0.26vs1.28±0.21，1.83±0.26vs1.38±0.22；p<0.01)。

6、1周、2周時(shí)，模型組與芪術(shù)顆粒組之間無(wú)差異(1.75±0.25vs1.68±0.26；1.56±0.44vs1.38±0.24；p>0.05)。4周時(shí)，模型對(duì)照組與芪術(shù)顆粒組之間有差異(1.83±0.26vs1.45±0.35；p<0.05)。
　　正常對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、模型對(duì)照組和芪術(shù)顆粒組大鼠肝組織總p38 MAPK的蛋白表達(dá)量在1周、2周和4周時(shí)間點(diǎn)之間比較均無(wú)差異(1.13±0.28vs1.22±0.26vs1.28±0

7、.21；1.30±0.26vs1.18±0.31vs1.38±0.22；1.75±0.25vs1.56±0.44vs1.83±0.26；1.68±0.26vs1.38±0.24vsl.45±0.35；p>0.05)。
　　2.芪術(shù)顆粒對(duì)大鼠肝組織p-p38 MAPK蛋白表達(dá)的影響
　　各組大鼠肝組織中在1周和2周兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，p-p38 MAPK蛋白微弱表達(dá)，顯色極淡。在4周p-p38 MAPK蛋白明顯表達(dá)，顯色較濃。

8、　　1周時(shí)，模型對(duì)照組與正常對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較有差異(0.36±0.11 vs0.21±0.07，0.36±0.11vs0.24±0.07；p<0.05)。2周和4周時(shí)，模型對(duì)照組與正常對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組之間比較無(wú)差異(0.40±0.12vs0.28±0.12，0.40±0.12vs0.31±0.10，1.51±0.41vs1.15±0.22，1.51±0.41vs1.22±0.13；p>0.05)，1周、2周和4周時(shí)三個(gè)時(shí)間點(diǎn)模型

9、對(duì)照組與芪術(shù)顆粒組之間無(wú)差異(0.36±0.11vs0.31±0.11，0.40±0.12vs0.37±0.14，1.51±0.41vs1.32+0.45；p>0.05)。
　　實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、正常對(duì)照組、模型對(duì)照組及芪術(shù)顆粒組大鼠肝組織P-p38 MAPK的蛋白表達(dá)量在4周與1周、2周時(shí)間點(diǎn)之間均有顯著差異(1.15±0.22vs0.21±0.07、1.15±0.22vs0.28±0.12；1.22±0.13vs0.24±0.07、

10、1.22±0.13vs0.31±0.10；1.51±0.41vs0.36±0.11、1.51±0.41vs0.40±0.12，1.32±0.45vs0.31±0.11、1.32±0.45vs0.37±0.14，p<0.01)。4組的1周與2周之間無(wú)差異(p>0.05)。
　　3.芪術(shù)顆粒對(duì)大鼠肝組織總ATF-2蛋白表達(dá)的影響
　　各組大鼠肝組織在1周和2周兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，總ATF-2蛋白微弱表達(dá)，顯色極淡。在4周大鼠肝組織中AT

11、F-2蛋白明顯表達(dá)，顯色較濃。
　　1周時(shí)，模型對(duì)照組、芪術(shù)顆粒組與正常對(duì)照組比較無(wú)差異(0.85±0.21vs0.61±0.14，0.81±0.33vs0.61±0.14；p>0.05)，模型對(duì)照組與芪術(shù)顆粒組之間無(wú)差異(0.85±0.21vs0.81±0.33，p>0.05)。2周時(shí)，模型對(duì)照組與正常組、實(shí)驗(yàn)組比較有差異(1.29±0.28vs0.75±0.22，1.29±0.28vs0.92±0.35；p<0.05)，模型對(duì)

12、照組與芪術(shù)顆粒組之間無(wú)差異(1.29±0.28vs1.13±0.26；p>0.05)。4周時(shí)，模型對(duì)照組、芪術(shù)顆粒組與正常組比較有顯著差異(1.51±0.26vs1.12±0.21，1.44±0.36vs1.12±0.21；p<0.01)，模型對(duì)照組與芪術(shù)顆粒組之間無(wú)差異(1.51±0.26vs1.44±0.36；p>0.05)。
　　正常對(duì)照組大鼠肝組織總p38 MAPK的蛋白表達(dá)量在4周與1周、2周時(shí)間點(diǎn)之間比較均有顯著差異(

13、1.12±0.21vs0.61±0.14，1.12±0.21vs0.75±0.22；p<0.01)。芪術(shù)顆粒組和模型對(duì)照在1周和4周之間有顯著差異(1.44±0.36vs0.81±0.33，1.51±0.26vs0.85±0.21；p<0.01)。
　　4.芪術(shù)顆粒對(duì)大鼠肝組織磷酸化ATF-2蛋白表達(dá)的影響
　　各組大鼠肝組織在1、2周兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，p-ATF-2蛋白微弱表達(dá)，顯色極淡。在4周大鼠肝組織中ATF-2蛋白明顯表達(dá)

14、，顯色較濃。
　　1周時(shí)，模型對(duì)照組與正常對(duì)照組有顯著差異(0.58±0.14vs0.38±0.14；p<0.01)、與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較有差異(0.58±0.14vs0.38±0.04；p<0.05)。模型對(duì)照組與芪術(shù)顆粒組之間無(wú)差異(0.58±0.14vs0.55±0.14：p>0.05)。2周時(shí)，模型對(duì)照組與正常對(duì)照組有顯著差異(1.11±0.38vs0.62±0.13；p<0.01)、與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較有差異(1.11±0.38

15、vs0.71±0.25；p<0.05)；模型對(duì)照組與芪術(shù)顆粒組之間無(wú)差異(1.11±0.38vs0.85±0.35；p>0.05)。4周時(shí)，模型對(duì)照組、芪術(shù)顆粒組與正常對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較均有差異(1.77±0.41vs1.13±0.38，1.77±0.41vs1.29±0.31；1.38±0.40vs1.13±0.38，1.38±0.40vs1.29±0.31；p<0.05)，模型對(duì)照組與芪術(shù)顆粒組之間無(wú)差異(1.77±0.41vs

16、1.38±0.40；p>0.05)。
　　實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、正常對(duì)照組、模型對(duì)照組及芪術(shù)顆粒組大鼠肝組織p-ATF-2的蛋白表達(dá)量在4周與1周、2周時(shí)間點(diǎn)之間均有顯著差異(1.13±0.38vs0.38±0.14，1.13±0.38vs0.62±0.13:1.29±0.31vs0.38±0.04，1.29±0.31vs0.71±0.25；1.77±0.41vs0.58±0.14，1.77±0.41vs1.11±0.38；1.38±0.4

17、0vs0.55±0.14，1.38±0.40vs0.85±0.35；p<0.01)。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和模型對(duì)照組的1周與2周之間比較有差異(0.38±0.04vs0.71±0.25，0.58±0.14vs1.11±0.38；p<0.05)。
　　5.電鏡觀察結(jié)果
　　正常對(duì)照組：大鼠肝細(xì)胞呈圓形或卵圓形，細(xì)胞界限清楚，細(xì)胞膜完整光滑，可見(jiàn)膽小管。胞質(zhì)豐富，可見(jiàn)數(shù)量較多的圓形線粒體，嵴清晰，無(wú)腫脹。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列整齊，表面附著核糖體

18、顆粒，高爾基復(fù)合體及大量散在的糖原顆粒。核膜清晰可見(jiàn)，完整連續(xù)，可見(jiàn)核仁。肝SEC有許多窗孔，在Disse間隙中，有豐富的肝細(xì)胞微絨毛及貯脂細(xì)胞。
　　實(shí)驗(yàn)對(duì)照組：肝臟超微結(jié)構(gòu)的改變與正常組基本相同。
　　模型對(duì)照組：大鼠CCL4造模1周后，肝細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)大小不等的脂質(zhì)滴，部分肝細(xì)胞呈空泡狀為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)嚴(yán)重?cái)U(kuò)張所致，較多的圓形線粒體，嵴清晰，糖原顆粒較正常組少。Disse間隙中有豐富的肝細(xì)胞微絨毛，SEC有許多窗孔，外無(wú)基膜結(jié)

19、構(gòu)。2周時(shí)變化：模型組肝細(xì)胞輕度或重度損害，輕度損害者肝細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)大小不等的脂質(zhì)滴，糖原顆粒較正常組少。重度損害者肝細(xì)胞呈空泡狀，為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)嚴(yán)重?cái)U(kuò)張所致。Disse間隙中可見(jiàn)肝細(xì)胞微絨毛，SEC有較多窗孔，內(nèi)皮細(xì)胞外無(wú)基膜結(jié)構(gòu)，未見(jiàn)膠原纖維增生。4周時(shí)，模型組肝細(xì)胞胞漿內(nèi)的脂滴融合呈大脂滴，將細(xì)胞核擠壓，有核仁出現(xiàn)核固縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)嚴(yán)重?cái)U(kuò)張致肝細(xì)胞呈空泡狀改變，較多的線粒體內(nèi)室擴(kuò)張，基質(zhì)變稀，電子密度明顯下降，嵴變得短而少，移至邊緣或發(fā)生

20、斷裂。較多成纖維細(xì)胞增生，旁有膠原纖維沉積。Disse間隙中可見(jiàn)肝細(xì)胞微絨毛，SEC窗孔較正常組明顯減少，內(nèi)皮細(xì)胞外無(wú)基膜結(jié)構(gòu)。
　　芪術(shù)顆粒組：大鼠1周時(shí)，肝細(xì)胞胞漿內(nèi)亦可見(jiàn)大小不等的脂質(zhì)滴，但較模型組少，未見(jiàn)肝細(xì)胞空泡狀改變，可見(jiàn)數(shù)量較多的線粒體，嵴清晰，糖原顆粒較多。Disse腔中有豐富的肝細(xì)胞微絨毛，肝SEC有許多窗孔，但與模型組比較無(wú)明顯差別，內(nèi)皮細(xì)胞外無(wú)基膜結(jié)構(gòu)；2周時(shí)，肝細(xì)胞出現(xiàn)輕度損害，胞漿內(nèi)可見(jiàn)大小不等的脂質(zhì)滴，

21、但較模型組少，糖原顆粒較多。Disse腔中有豐富的肝細(xì)胞微絨毛，觀察SEC窗孔與模型組無(wú)明顯差別，無(wú)膠原纖維增生。4周時(shí)，肝細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)大小不等的脂質(zhì)滴，部分脂滴融合呈大脂滴，將細(xì)胞核擠壓，未見(jiàn)肝細(xì)胞空泡狀改變，少量線粒體電子密度明顯下降，可見(jiàn)糖原顆粒，可見(jiàn)成纖維細(xì)胞，旁有膠原纖維增生。SEC窗孔較2周時(shí)減少，但所見(jiàn)窗孔多于模型組，內(nèi)皮細(xì)胞外無(wú)基膜結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)論：
　　芪術(shù)顆?？梢哉{(diào)節(jié)p38 MAPK信號(hào)通路，影響總p3