人類胰島microRNA的表達(dá)以及miR-148對(duì)胰島β細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控作用.pdf

1、微小RNA(microRNA)參與了2型糖尿?。═2D）發(fā)生發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)，調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞功能的microRNA已成為研究T2D的核心領(lǐng)域。發(fā)現(xiàn)人類胰島中microRNA的表達(dá)水平，并探討對(duì)胰島β細(xì)胞發(fā)育和增殖過(guò)程中起關(guān)鍵作用的microRNA，可以為研究預(yù)防、診斷以及治療T2D的新靶點(diǎn)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論前提。本研究通過(guò)灌注消化和連續(xù)梯度離心的方式，分離出人類的原代胰島；提取人類胰島總RNA，利用 Illumina測(cè)序技術(shù)平臺(tái)對(duì)人類胰島

2、進(jìn)行microRNA測(cè)序，篩選并分析人類胰島中microRNA的表達(dá)譜，采用real-time qPCR芯片技術(shù)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證；選擇人類胰島中高表達(dá)的microRNA—miR-148進(jìn)行功能分析和機(jī)制研究，將miR-148的抑制劑（Anti-miR-148）轉(zhuǎn)染入小鼠胰島打散細(xì)胞和胰島β細(xì)胞系 MIN6中，觀察Anti-miR-148對(duì)胰島β細(xì)胞增殖和凋亡的影響；利用real-time qPCR和western-blot技術(shù)篩選mi

3、R-148可能作用的靶基因，并用luciferase報(bào)告基因的方法檢驗(yàn)miR-148是否與所篩選靶基因的3’UTR互補(bǔ)結(jié)合。研究結(jié)果顯示，通過(guò)灌注消化和連續(xù)梯度離心的方法可以分離出純度和質(zhì)量都較高的人類原代胰島；對(duì)人類胰島進(jìn)行microRNAs測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)了約944種在人類胰島中表達(dá)的microRNAs，其中，拷貝數(shù)在400以上的有150余種；測(cè)序分析和real-time qPCR芯片驗(yàn)證結(jié)果基本一致；miR-148在人類胰島中具有較

4、高的表達(dá)豐度，Anti-miR-148可顯著降低胰島β細(xì)胞內(nèi)源性miR-148的表達(dá)，與對(duì)照組相比較，Anti-miR-148組細(xì)胞生長(zhǎng)減慢、S期細(xì)胞的比例減少，而早期凋亡細(xì)胞的比例增加；Real-time qPCR和western-blot結(jié)果顯示，Bim，P27和Pten基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均顯著增加；Luciferase報(bào)告基因驗(yàn)證結(jié)果顯示，miR-148可以與Bim，P27和Pten基因的3’UTR互補(bǔ)結(jié)合。綜上，我們