酶切富集PCR-焦磷酸測序技術檢測NSCLC患者癌組織及外周血KRAS基因突變.pdf

1、背景與目的:
　　多項多中心臨床試驗結果證實,對于發(fā)生EGFR敏感突變的NSCLC患者,表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor- tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)可明顯延長患者的無進展生存期(progression-free survival,PFS)及總生存期(overall survival,OS),但KRAS基因突變與患者對TK

2、I的原發(fā)耐藥密切相關,因此在進行 EGFR檢測的同時,進行 KRAS基因突變檢測能進一步增強 TKI靶向治療的的針對性。目前很多檢測技術已用于KRAS基因的檢測,但是多數(shù)檢測方法成本高、操作繁瑣、主觀性強,缺乏臨床實用性。因此,本研究建立簡便、高靈敏度的酶切富集-PCR聯(lián)合焦磷酸測序技術,檢測NSCLC患者癌組織與外周血中KRAS突變情況,用于臨床NSCLC患者的靶向治療篩查,為選擇最佳用藥人群提供依據(jù)。
　　方法:
　　收

3、集晚期NSCLC患者癌組織及配對的外周血樣本43例,運用酶切富集-PCR聯(lián)合焦磷酸測序技術,檢測癌組織及配對的外周血樣本中 KRAS基因常見的12、13密碼子突變情況,通過以不同比例混合KRAS突變型細胞系A549和KRAS野生型細胞系HCC827,測定酶切富集-PCR聯(lián)合焦磷酸測序技術的靈敏度;分析癌組織與其配對的外周血標本突變狀態(tài)的一致性,建立一種可以經(jīng)外周血檢測KRAS基因突變的檢測手段。
　　結果:
　　1.在配對的

4、43例NSCLC患者癌組織中檢測到4例KRAS基因突變,均為12密碼子突變;2例突變類型為GGT→AGT,2例突變類型為GGT→GAT;突變率為9.3％(4/43)。
　　2.在配對的43例NSCLC患者外周血樣本中檢測到3例KRAS基因突變,均為12密碼子突變;2例突變類型為GGT→AGT,1例突變類型為GGT→GAT;突變率為7%(4/43)。以癌組織樣本中的KRAS基因突變?yōu)榛鶞?突變一致性為75.0%(3/4)。
　

5、　3.按不同比例混合 KRAS基因野生型的 HCC827細胞株與KRAS基因突變型的A549細胞株,當混合比例小于1000:1時,可觀察到突變峰,表明酶切富集-PCR聯(lián)合焦磷酸測序技術的靈敏度為0.1%。
　　結論:
　　1.晚期NSCLC患者存在KRAS基因突變,其癌組織突變率為9.3%。
　　2.晚期NSCLC患者癌組織和外周血中KRAS基因突變狀態(tài)具有高度的一致性,提示在組織取材困難的情況下,外周血樣本可以替代組

6、織樣本進行基因檢測;在行分子靶向治療前,外周血中KRAS基因突變狀態(tài)也可以作為一個有效的參考指標。
　　3.本實驗成功地建立了酶切富集 PCR-焦磷酸測序檢測 NSCLC患者癌組織及外周血 KRAS基因突變技術。酶切富集-PCR通過引入特異的限制性內切酶,能更有效地使KRAS突變基因得到富集;在此基礎上,聯(lián)合焦磷酸測序技術,能大樣本、高通量、精確地檢測KRAS基因突變,能有效為NSCLC患者是否適合TKI治療提供實驗依據(jù),給患者帶