雞傳染性支氣管炎病毒感染HeLa細胞的研究及其天然受體的鑒定.pdf

1、雞傳染性支氣管炎(IB)是由雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)引起的一種高度接觸性的病毒性傳染病。主要引起雞的呼吸系統(tǒng)疾病、腎炎并伴隨產蛋量和蛋品質的下降。IBV 屬于冠狀病毒科，為單股正鏈RNA病毒。大部分冠狀病毒具有宿主特異性和組織嗜性，只能侵染天然宿主和一些親緣關系極其相近的宿主。以前的研究認為IBV只能感染雞，但近兩年相繼在其他一些雞形目的動物體內分離到IBV樣病毒，如孔雀、幾內亞雞和鷓鴣等，這些分離的毒株在基因結構上與IBV很相似

2、，基因序列的同源性甚至達到99％以上；而在非雞形目動物如鴨、鴿子和灰雀等的體內分離到的病毒，通過基因組序列比對發(fā)現，雖然它們在氨基酸同源性上與IBV存在一定的差異，但依然屬于第3群冠狀病毒的范疇。 IBV這種從感染單一宿主延伸到更多的其他動物的現象，讓人聯想到2002年爆發(fā)的“嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥”(SARS)，它的病原是一種新的冠狀病毒(嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒， SARS-CoV)，而在多種動物體內分離到的SARS-

3、CoV樣冠狀病毒說明SARS-CoV極有可能最初起源于動物。因此，研究動物冠狀病毒與SARS-CoV的關系及冠狀病毒跨越物種屏障的機制很有必要。 基于此，本研究以IBV為模式病毒，將其跨種感染人源細胞 HeLa，探討動物冠狀病毒跨種感染的機制，同時對IBV跨種感染過程中起到關鍵作用的因子進行了研究，另外也鑒定了IBV的天然受體。主要研究內容如下： 1、不同IBV毒株跨種感染HeLa細胞的研究7個不同的IBV毒株，包括M4

4、1、H52、H120、Gray、Holte、Connecticut和M52-19(Beaudette52-19)，分別接種單層和剛剛消化的 HeLa 細胞。結果顯示這些毒株均不能在單層的HeLa細胞上增殖；而M41、H52、H120和Gray可以在剛剛新鮮消化的HeLa細胞上增殖，并會導致HeLa細胞發(fā)生明顯的病變，剩余的3個毒株Holte、Connecticut和M52-19卻不能。通過觀察是否產生細胞病變及中和實驗、S1基因的RT-

5、PCR擴增、血凝及血凝抑制、病毒N蛋白的Western blotting檢測等方面來證實感染的真實性。 2、S1基因的變異在IBV跨種感染過程中的作用M41毒株在新鮮消化的HeLa細胞上持續(xù)傳26代，RT-PCR擴增第1代、第5代和第21代病毒的S1基因，結果顯示第1代跟第5代S1基因的序列完全一致，而第21代與第1代相比也僅僅只有一個堿基(A728G)的改變，導致一個氨基酸的變異。然而這唯一的一個點突變對 IBV的跨種感染似乎

6、沒有決定性的作用。 3、病毒血凝價的改變與跨種感染的關系據報道IBV經胰酶或磷酸脂酶C處理后可以凝集0.5％的新鮮制備的雞紅細胞。本研究發(fā)現在上述7個IBV的毒株中，M41、H52、H120和Gray經磷酸脂酶處理后可以凝集雞紅細胞，而另外3個毒株Holte、Connecticut和M52-29則不能凝集；另一方面，M41在HeLa細胞上持續(xù)傳代會導致M41的血凝價逐漸下降；但這些傳代的細胞毒(低或無血凝性)接種雞胚后，尿囊液中

7、的病毒會重新獲得較高的血凝價。可見具有血凝性的IBV毒株更易于適應異源細胞。 4、唾液酸糖蛋白(脂)在IBV跨種感染過程中的作用某些冠狀病毒可以利用細胞表面的唾液酸糖蛋白(脂)作為進入細胞的受體，而神經氨酸酶(NA)可以降解細胞表面的唾液酸糖蛋白(脂)，這樣就會降低病毒感染的幾率。根據這一原理，將 IBV 感染經 NA 處理和未處理的 HeLa 細胞，對比發(fā)現IBV在NA處理過的HeLa細胞的感染滴度明顯降低，說明唾液酸糖蛋白(

8、脂)在IBV感染 HeLa 細胞的過程中起到重要的作用。 5、氨基肽酶N、胰酶和EDAT對IBV跨種感染的作用氨基肽酶(APN)是很多冠狀病毒的受體，通過封閉細胞表面APN的受體功能可以達到阻斷病毒感染細胞的目的。用鼠抗人氨基肽酶(hAPN)的單克隆抗體(WM15)封閉 HeLa 細胞表面的氨基肽酶的活性，結果發(fā)現這種封閉并沒有阻斷 IBV 感染HeLa細胞，這說明hAPN不是IBV感染 HeLa 細胞的途徑。 以前的研

9、究證實胰酶可以提高某些病毒的滴度。先確定胰酶的安全濃度，然后在IBV接種后將此安全濃度胰酶添加到的細胞培養(yǎng)液里，結果顯示添加了胰酶的IBV的感染力與單獨使用IBV是一樣的；另外，IBV對經EDTA消化HeLa細胞與經胰酶消化的HeLa細胞的感染滴度是相同的。這說明胰酶、EDTA不是 IBV 跨種感染所必需的。 6、鑒定IBV的天然受體研究證實IBV的一個毒株(Ark99)可以利用貓的氨基肽酶(fAPN)作為細胞受體。本研究通過克

10、隆雞的APN(gAPN)，探討gAPN作為IBV天然受體的可能性。 RT-PCR擴增到全長的gAPN基因，分別在原核和真核表達載體中進行表達。將原核表達的gAPN蛋白進行的ELISA及Western blotting試驗證實原核表達的gAPN蛋白在體外可以與IBV結合，而且這種結合可以被針對gAPN的抗體阻斷。 將gAPN轉染 IBV的非敏感細胞(PK-15、HeLa)，構建真核表達體系。通過間接免疫熒光、流式細胞術、半