LeukameninE對(duì)原代培養(yǎng)大鼠腦星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞毒性作用的研究.pdf

1、毒理學(xué)是研究化學(xué)物質(zhì)對(duì)生物體的毒性反應(yīng)及其嚴(yán)重程度、發(fā)生頻率和毒性作用機(jī)制，也是對(duì)毒性作用進(jìn)行定性和定量評(píng)價(jià)的一門(mén)學(xué)科。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)等生物技術(shù)由于其高通量、高精度、快速以及平行性的特點(diǎn)，已成為生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中的一項(xiàng)先進(jìn)實(shí)用的技術(shù)，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。毒理學(xué)的研究必定要深入到細(xì)胞及分子水平。中藥（尤其是其復(fù)方制劑）成分復(fù)雜，應(yīng)用傳統(tǒng)方法評(píng)價(jià)中藥的遺傳毒性十分困難，而借助現(xiàn)代細(xì)胞學(xué)技術(shù)，從細(xì)胞水平上對(duì)藥物在體外進(jìn)行準(zhǔn)確、快速、高效的安全性

2、評(píng)價(jià)，使得我們能從微觀(guān)角度更好地了解中藥遺傳毒性的作用靶點(diǎn)及其作用機(jī)制。
　　 星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（astrocyte，AS），作為神經(jīng)系統(tǒng)中起營(yíng)養(yǎng)、支持及保護(hù)神經(jīng)元作用的一類(lèi)細(xì)胞，由于其敏感性高，更易受到毒性物質(zhì)的損傷。許多證據(jù)表明，星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在許多神經(jīng)退行性疾病中有十分重要的作用。迄今為止，有關(guān)星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞毒性的研究尚未見(jiàn)到報(bào)道。
　　 香茶菜屬植物幾乎遍布我國(guó)各地，并且種類(lèi)繁多，約有30種原植物在民間作藥用

3、，具有清熱解毒、活血化淤、抗菌消炎、抗腫瘤、治療肝炎等各種功效。在藥用香茶菜中，二萜類(lèi)化合物含量豐富，是其主要的活性成分。其中C-20-未氧化-對(duì)映-貝殼杉烯型二萜化合物是生物活性最強(qiáng)的一類(lèi)，Leukamenin E即為其中的一種。
　　 本論文進(jìn)行了Wistar 大鼠星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的純化培養(yǎng)，以對(duì)映-貝殼杉烯二萜化合物L(fēng)eukamenin E為受試藥物，通過(guò)SRB檢測(cè)、臺(tái)盼藍(lán)排染、彗星電泳、吖啶橙/溴化乙錠（AO/EB）雙染

4、、細(xì)胞形態(tài)的觀(guān)察及核染色質(zhì)形態(tài)觀(guān)察等方法，初步研究了該化合物對(duì)星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響以及其作用機(jī)制，以期為L(zhǎng)eukamenin E的進(jìn)一步合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。結(jié)果如下：
　　 (1)成功培養(yǎng)了AS并對(duì)其進(jìn)行了純化。實(shí)驗(yàn)通過(guò)組織消化、限制性培養(yǎng)以及搖床震蕩等方法，得到了純度高、狀態(tài)良好的AS培養(yǎng)物。原代培養(yǎng)的AS在接種后2-3d完成貼壁，9-12d即可鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底。初級(jí)培養(yǎng)物含有包括小膠質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、少量神經(jīng)元在內(nèi)的多

5、種細(xì)胞，通過(guò)限制性培養(yǎng)降低這些細(xì)胞的含量，而神經(jīng)元逐漸退化，最終死亡；搖床震蕩利用細(xì)胞差速貼壁的原理，除去雜細(xì)胞，最終得到純度較高的AS培養(yǎng)物。
　　 (2)SRB法及臺(tái)盼藍(lán)排染法檢測(cè)細(xì)胞毒性結(jié)果顯示，Leukamenin E對(duì)AS有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，在0.625μM以及1.25μM的低濃度作用下對(duì)細(xì)胞具有顯著的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)，而在5μM以及10μM的高濃度作用時(shí)能致細(xì)胞死亡。生長(zhǎng)抑制效應(yīng)和致死效應(yīng)都具有顯著的時(shí)間、劑量依賴(lài)性。

6、r>　　 (3)倒置顯微鏡形態(tài)觀(guān)察及吉姆薩染色顯示，Leukamenin E作用可以引起細(xì)胞形態(tài)的顯著改變，并且有明顯的時(shí)間、劑量效應(yīng)。吉姆薩染色實(shí)驗(yàn)中，隨化合物濃度的增加（1.25μM、2.5μM），細(xì)胞膜表面微絨毛不清晰甚至消失，細(xì)胞核染色質(zhì)凝集，在高濃度藥物（5μM）作用下，觀(guān)察到核碎裂。
　　 (4)彗星電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，化合物L(fēng)eukamenin E可以引起AS DNA的損傷，并具有時(shí)間-劑量效應(yīng)。隨著化合物作用濃度