黃渤海來源放線菌集成篩選及次級(jí)代謝產(chǎn)物研究.pdf

1、作為天然活性物質(zhì)重要來源的微生物資源——放線菌,其開發(fā)和利用一直備受關(guān)注。生存于海洋這個(gè)特殊生態(tài)環(huán)境中的放線菌,必定具備了不同于陸地放線菌的獨(dú)特代謝途徑,這就為結(jié)構(gòu)新穎、生物活性良好的藥物先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)提供了重要資源。
　　基于本實(shí)驗(yàn)室化學(xué)-基因-活性集成篩選模型,本論文對(duì)黃渤海海泥樣品中的放線菌進(jìn)行了分離和集成篩選,并對(duì)兩株目標(biāo)菌株進(jìn)行次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究。主要內(nèi)容包括:海洋來源放線菌的分離與純化;菌株的化學(xué)-基因-活性集成篩選

2、;目標(biāo)菌株發(fā)酵條件的考察及發(fā)酵;單體化合物分離純化、結(jié)構(gòu)確定及生物活性評(píng)價(jià);潛力菌株的OSMAC策略研究。
　　本研究從黃海和渤海兩個(gè)來源的17個(gè)海泥樣品中分離到142株放線菌,并結(jié)合實(shí)驗(yàn)室原有的海洋放線菌資源庫中的221株放線菌一起進(jìn)行菌株篩選。經(jīng)化學(xué)篩選后共獲得107株次級(jí)代謝產(chǎn)物豐富的潛力菌株,通過對(duì)HPLC指紋圖譜分析,設(shè)計(jì)基于PKS I功能基因的特異性引物對(duì)其中13株菌進(jìn)行基因篩選,獲得3株基因篩選呈陽性的菌株,選取其中

3、一株HPLC圖譜特征的放線菌LXF-80為本文的重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)菌株。同時(shí),對(duì)化學(xué)篩選后的107株菌采用小鼠白血病細(xì)胞P388,經(jīng)SRB法活性測(cè)試獲得46株具有良好抗腫瘤活性的菌株,從中選取一株HPLC圖譜呈系列吸收且 PKS I基因篩選呈陽性的放線菌 LXF-75作為另一株重點(diǎn)菌株。由于菌株LXF-80產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物較為特別,本研究采取OSMAC策略通過添加生物合成途徑抑制劑對(duì)其進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。
　　綜合利用硅膠柱層析、凝膠柱層析和

4、半制備HPLC等方法對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯萃取物進(jìn)行分離提取,從菌株LXF-80的發(fā)酵浸膏中分離到了12個(gè)化合物,包括1個(gè)新天然產(chǎn)物YT87(b)(1),1個(gè)enterocin類化合物(2),1個(gè)萜類化合物(3),5個(gè)環(huán)二肽類化合物(4-8),4個(gè)苯的衍生物(9-12);從菌株LXF-80添加抑制劑培養(yǎng)的乙酸乙酯萃取物浸膏中分離到2個(gè)化合物5-deoxyenterocin(13),3-epi-5-deoxyenterocin(14);從菌

5、株LXF-75中分離到了12個(gè)化合物,5個(gè)二酮哌嗪類化合物(15-19),其中化合物15為新化合物,其他類化合物1個(gè)(20),苯的衍生物6個(gè)(21-26)。
　　采用MTT和SRB法,以P388、 Hela、A-549、HL-60、K562等5種細(xì)胞藥理模型對(duì)分離到的單體化合物1-2、15-20進(jìn)行了初步體外抗腫瘤活性評(píng)價(jià),結(jié)果顯示,在50μM的終濃度下,化合物15對(duì)Hela細(xì)胞的抑制率為90.58％,化合物16對(duì)Hela細(xì)胞的抑

6、制率為89.84%,評(píng)測(cè)兩個(gè)化合物對(duì)Hela細(xì)胞抑制活性的IC50分別為:化合物15為30.1μM,化合物16為15.6μM。
　　綜上所述,本研究從兩株黃渤海海泥來源的放線菌中分離并解析了26個(gè)化合物的結(jié)構(gòu),包括1個(gè)新化合物和1個(gè)新天然產(chǎn)物,通過活性評(píng)價(jià),發(fā)現(xiàn)了化合物15和16有一定抗Hela細(xì)胞活性,為海洋放線菌的天然產(chǎn)物的研究提供了豐富的資源。此外,隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,通過基因篩選結(jié)合化學(xué)篩選,定向的追蹤目標(biāo)化合物,極大提