黃瓜肌動蛋白基因及矮牽?；ㄌ禺愋詥幼拥目寺『头治?pdf

1、雄性不育在植物界中是一種常見現象，由于雄性不育是雜種優(yōu)勢利用的基礎，對雄性不育機理的探索具有重要的應用價值。已有研究表明，植物肌動蛋白與雄性不育有關，而黃瓜性別決定形式復雜多樣，其中全雌株只開雌花而無雄花，類似于雄性不育，因此研究黃瓜肌動蛋白與雄性不育的關系，將有助于對雄性不育的發(fā)生機理的全面認識。本研究分別從黃瓜和矮牽牛中克隆了肌動蛋白基因和花特異啟動子，并進行了相關分析，主要結果如下。
　　1、通過1次PCR擴增從全雌性黃瓜中

2、同時獲得了長度分別為1186bp、955bp和870bp的3個肌動蛋白基因片段 Act1、Act2和Act3（GenBank登錄號：DQ115881、DQ115882和DQ115883）。序列分析表明，3個肌動蛋白基因片段與GenBank中收錄的肌動蛋白基因序列（如AF386514.1、AF059484.1和AB010922.1等）高度同源。Act1中1~580bp、984~1186bp，Act2中1~580bp、753~955bp，A

3、ct3中1~580bp、753~955bp為外顯子編碼區(qū)，其余為內含子序列，3個基因內含子的兩端序列均符合典型的“GT-AG”規(guī)則。RT-PCR分析表明，Act1基因僅在根中表達，Act2基因在根和雌花中表達，而Act3基因在所有檢測的器官（包括根、莖、葉、卷須、雌花和幼果）中都表達，提示黃瓜根的生長發(fā)育可能需要多種肌動蛋白基因的參與，而Act2和Act3可能與黃瓜雌性系的形成發(fā)育有關。
　　2、通過1次PCR擴增從矮牽?；蚪MD

4、NA中同時擴增出長為550bp和354bp的兩個花特異表達的啟動子（分別命名為PchsA-L和PchsA-S；GenBank登錄號：EF199747和EF199748），其中PchsA-L與PchsA-S相比，除個別堿基有差異外，在第88~269bp多出一段182bp的序列，該182bp序列第103~201bp含有典型的內含子特征。通過BLAST軟件分析，PchsA-L與GenBank中chsA基因啟動子序列AY360358、S5298

5、4和X14591最大相似片段的相似性分別為97％（228/234）、96%（145/151）和96%（145/151）；其第103~201bp區(qū)域與矮牽牛chsD基因（GenBank登錄號X14593）相似性為94%（73/77），與GenBank登錄號AB244234、AB244229和AB244221的F3’，5’H（falvonoid3’，5’-hydroxylase）基因相似性均為94%（34/36），與GenBank登錄號AB

6、244228的F3’，5’H基因相似性為96%（27/28）。PchsA-S與 AY360358、S52984和X14591最大相似片段的相似性分別為98%（348/354）、96%（262/271）、96%（262/271）。應用DNAStar軟件分析表明兩條序列均含有普通啟動子的保守序列TATA box、CCAAT box、cap site（CCATAA），并含有花特異表達啟動子的特征序列TACPyAT box、anther box

7、（TAGAAGTGACAGAAAT）、G-box（CACGTG）、box1元件（ATGTCACGTGCCATC）和box2元件（TGTGTTGAAGGTTTGCTA）。
　　對克隆啟動子所用的矮牽牛后代群體分析顯示，130個單株中只含有PchsA-S的共有13株，含有2個啟動子的共有97株，只含有PchsA-L的共有20株，其分離比并不符合1：2：1。對克隆啟動子所用的矮牽牛的染色體數目分析顯示，其含有14條染色體，為二倍體。

8、r>　　3、利用質粒pBIN19、pGFP、pCHS，分別構建了啟動子CaMV35S、PchsA-S和PchsA-L驅動的轉基因表達載體pBIN-35S-GFP、pBIN-PchsA-S-GFP和pBIN-PchsA-L-GFP，并導入野生型發(fā)根農桿菌K599。K599（分別含有3個不同啟動子驅動的表達載體）侵染矮牽牛葉片，均獲得轉基因不定根，并從不定根再生植株。對誘導的不定根和再生植株基因組 DNA的PCR檢測表明，野生型發(fā)根農桿菌K

9、599 Ri質粒中的rolB基因和外源gfp基因均成功轉入到矮牽?；蚪M中；并且，CaMV35S啟動子驅動的轉基因不定根和再生植株葉片在藍色光激發(fā)下都能發(fā)出強烈的綠色熒光，表明gfp基因實現了高效表達。
　　本研究結果為探討肌動蛋白與雄性不育之間的分子機理以及進一步利用基因工程創(chuàng)造雄性不育提供了重要基礎。此外，獲得的啟動子CaMV35S、PchsA-S和PchsA-L驅動的轉基因植株為進一步分析啟動子PchsA-S和PchsA-L