沙門氏菌特異性靶點(diǎn)的篩選及熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立.pdf

1、本研究利用生物信息學(xué)手段,通過比對(duì)沙門氏菌及其他原核生物的基因組序列,發(fā)掘出361段沙門氏菌特異性片段作為候選分子檢測(cè)靶點(diǎn)。從這些序列中隨機(jī)挑選出30個(gè)序列片段,設(shè)計(jì)普通PCR引物,并用58株沙門氏菌菌株和22株非沙門氏菌菌株對(duì)每對(duì)引物的檢測(cè)特異性進(jìn)行評(píng)價(jià),篩選出15對(duì)特異性較好的引物。經(jīng)進(jìn)一步靈敏度評(píng)價(jià),得到6對(duì)檢測(cè)靈敏度較好的引物,分別為:c1(36.5fg/PCR,500 cfu/mL);c3(36.5fg/PCR,500 cfu

2、/mL);c20(36.5fg/PCR,500cfu/mL);c23(36.5fg/PCR,5×104cfu/mL);c24(36.5fg/PCR,500cfu/mL)和plc(36.5fg/PCR,500cfu/mL)。用鼠傷寒沙門氏菌(ATCC14028)人為污染牛奶樣品后,用建立好的普通PCR方法進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證,當(dāng)初始接種菌量為8 cfu/25g牛奶時(shí),引物c3,c20,c24和plc均能在增菌6-8小時(shí)內(nèi)檢出陽性結(jié)果;而嚴(yán)重污染的

3、牛奶樣品(＞104cfu/25g牛奶)則只需增菌2-4小時(shí)即可檢出沙門氏菌。在普通PCR方法的基礎(chǔ)上,挑選出一段特異性較好的沙門氏菌基因組片段,設(shè)計(jì)出MGB-TaqMan探針p4以及相應(yīng)的引物。同時(shí),利用DNA隨機(jī)重組技術(shù)構(gòu)建擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)探針,合成單鏈寡核苷酸直接作為內(nèi)標(biāo)模板,以指示由PCR抑制劑等因素引起的假陰性結(jié)果,建立沙門氏菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法,并對(duì)其特異性、靈敏度、抗干擾性以及在食品樣品中的實(shí)際檢測(cè)能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。經(jīng)40株沙門氏菌

4、和24株非沙門氏菌檢測(cè)驗(yàn)證,熒光定量PCR具有良好的特異性,以腸炎沙門氏菌(CDC H3526)基因組DNA作為模板,檢測(cè)靈敏度達(dá)到18.6fg/PCR;以鼠傷寒沙門氏菌(CDC G7601)基因組DNA作模版,PCR反應(yīng)檢測(cè)靈敏度為40.2fg/PCR。在雞肉樣品中自然存在背景菌群的干擾下,PCR檢測(cè)限為130cfu/mL,且PCR定量結(jié)果與實(shí)際接入的沙門氏菌量處于相同或相近水平。用所建立的熒光定量PCR方法檢測(cè)人工污染至雞肉樣品中的