TROP2對宮頸癌生物學行為的影響及Anti-TROP2-HGNs近紅外熱療對宮頸癌作用的實驗研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 TROP2在宮頸癌中的表達及與Ki-67的相關性研究
　　目的:
　　檢測并分析TROP2在宮頸病變組織中的表達，探討TROP2的表達在宮頸癌細胞增殖中的作用及與患者臨床病理特征、預后的相關性。
　　方法:
　　采用免疫組織化學方法檢測20例正常宮頸組織、34例宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)、106例宮頸癌中TROP2及Ki-67蛋白的表達;卡方檢驗分析TROP2表

2、達水平與臨床病理特征的相關性;Spearman檢驗法分析TROP2和Ki-67表達的相關性;單因素和多因素Cox回歸分析宮頸癌患者預后的影響因素;Kaplan-Meier法繪制患者的生存曲線;Log-rank檢驗分析比較患者的總體生存率和無進展生存率的差別。
　　結(jié)果:
　　1.TROP2主要表達于病變宮頸組織的細胞膜。在正常宮頸組織中，8例(40％)呈弱陽性表達，1例(5％)中等陽性，無強陽性表達。TROP2在CIN組中的

3、表達率呈現(xiàn)遞增趨勢，其中CINⅠ陽性率為50％，CINⅡ陽性率為66.7％，CINⅢ陽性率為76.9％，且差異有統(tǒng)計學意義(p=0.037)。宮頸癌組織中TROP2表達率最高，為88.7％，明顯高于CIN和正常宮頸組織，三者比較，差異存在統(tǒng)計學意義(p＜0.001)。
　　2.TROP2的表達與宮頸癌組織學分化程度、FIGO臨床分期、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關系密切，而與宮頸癌患者年齡(p=0.1)及腫瘤直徑(P=0.255)無明顯相

4、關性。
　　3.Ki-67在正常宮頸組織、CIN、宮頸癌中的表達陽性率逐漸升高，陽性率依次為25％(5/20)，55.9％(19/34)，79.2％(84/106)，三組差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.001)。相關性Spearman相關分析顯示，TROP2和Ki-67在宮頸癌組織中的表達具有顯著相關性(r=0.440，p＜0.001)。
　　4.TROP2高表達病人與低表達病人相比，表現(xiàn)出更低的OS和PFS。應用多因素Cox回歸

5、分析，結(jié)果顯示，TROP2蛋白表達水平、組織學分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響宮頸癌預后的獨立因素。
　　結(jié)論:
　　1.TROP2在正常宮頸組織、CIN組織、宮頸癌組織中表達量逐漸升高，且TROP2的高表達與宮頸癌的不良臨床病理特征相關，說明TROP2參與了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程。
　　2.TROP2與Ki-67的表達呈正相關，說明TROP2可能參與了宮頸癌細胞的生長及增殖過程。
　　3.TROP2的高表達影響宮頸癌患者的

6、預后，是評價宮頸癌預后的獨立因素。
　　第二部分 TROP2的表達對宮頸癌生物學行為的影響及相關機制研究
　　目的:
　　探討TROP2的表達對宮頸癌細胞生長增殖、凋亡、周期、侵襲轉(zhuǎn)移及化療耐藥等能力的影響，探討TROP2在宮頸癌發(fā)病中的作用機制。
　　方法:
　　通過siRNA干擾沉默宮頸癌Siha和CaSki細胞中TROP2的表達，pcDNA3.1TROP2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過表達HeLa和C33A細胞中TROP

7、2的表達。Western blot技術檢測并確認干擾效率之后，CCK8法檢測TROP2表達水平的改變對宮頸癌細胞增殖能力的影響;AnnexinⅤ-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡;流式細胞儀檢測細胞周期;細胞劃痕實驗及Transwell小室測定細胞遷移及侵襲能力;Western blot檢測凋亡、周期、侵襲相關蛋白表達的變化及與ERK/MAPK信號通路的相關性;應用不同濃度的順鉑作用于TROP2基因沉默后的Siha和CaSki細胞，CCK

8、-8法繪制細胞生存曲線，比較IC50，并分析化療耐藥與TROP2的表達及ERK1/2信號通路的相關性。
　　結(jié)果:
　　1.Western blot檢測TROP2在Siha，HeLa，CaSki和C33A細胞中均有表達，設計并合成的siRNA-1100和siRNA-550序列均能有效地減少TROP2的表達，干擾效率在70％以上;真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1 TROP2轉(zhuǎn)染之后，TROP2蛋白表達量明顯升高，確定瞬時轉(zhuǎn)染成功。

9、
　　2.CCK-8法研究發(fā)現(xiàn)，TROP2基因沉默的Siha和CaSki細胞增殖能力明細下降(p＜0.05)，而過表達TROP2的HeLa和C33A細胞在轉(zhuǎn)染后2-4天增殖能力明顯增加(p＜0.05)。
　　3.AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法通過流式細胞儀檢測細胞凋亡，發(fā)現(xiàn)TROP2基因表達沉默之后，Siha和CaSki細胞早期和晚期凋亡率明顯升高，總凋亡率也顯著提高(p＜0.05)。相反，HeLa和C33A細胞在T

10、ROP2表達上調(diào)之后早期凋亡、晚期凋亡率及總凋亡率均明顯下降(p＜0.05)。TROP2基因沉默后的Siha和CaSki細胞Bcl-2表達顯著降低，而Bax表達量上升。而TROP2過表達的HeLa和C33A細胞，Bcl-2表達上調(diào)而Bax表達下調(diào)。
　　結(jié)論:
　　1.TROP2參與了宮頸癌細胞增殖、凋亡、周期、遷移和侵襲等惡性生物學行為，干擾其表達提高了對順鉑的敏感性。說明TROP2在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中有著重要的作用，并對

11、宮頸癌靶向治療提供理論依據(jù)。
　　2.TROP2在宮頸癌細胞中與ERK/MAPK信號通路存在關聯(lián)，影響腫瘤細胞的增殖、凋亡、化療耐藥等惡性生物學行為。
　　第三部分 Anti-TROP2/空心納米金球近紅外熱療對宮頸癌細胞作用的實驗研究
　　目的:
　　研制合成具有腫瘤細胞靶向作用的空心納米金顆粒，評價HGNs及anti-TROP2/HGNs近紅外熱療對宮頸癌HeLa細胞的生長抑制及殺傷作用，進一步揭示納米材料聯(lián)

12、合近紅外熱療對腫瘤細胞的作用機制。
　　方法:
　　采用濕化學法，首先制備合成納米銀粒子，然后以此為模板，加入氯金酸還原得到HGNs。用異官能團的聚已二醇SH-PEG-COOH作為連接劑將HGNs與anti-TROP2抗體共價鍵偶聯(lián)，HGNs與mPEG-SH孵育形成mPEG/HGNs作為對照。通過透射電鏡，紫外分光光度計等對合成的納米粒子進行表征。通過CCK-8的方法檢測HGNs對宮頸癌HeLa細胞的毒性。倒置顯微鏡及TEM

13、觀察納米金粒子在HeLa細胞內(nèi)的分布及攝取情況。CCK-8方法檢測在不同功率的近紅外激光照射下，mPEG/HGNs及anti-TROP2/HGNs對HeLa細胞生長抑制的程度。光鏡下觀察HeLa細胞經(jīng)過光熱治療后的形態(tài)變化。流式細胞儀檢測細胞凋亡率。Hoechst進行凋亡染色分析。Western blot方法檢測光熱治療后bcl-2和bax的表達變化。共聚焦顯微鏡觀察γ-H2AX的表達變化。
　　結(jié)果:
　　1.合成的HGN

14、s形態(tài)規(guī)則，呈中空的圓球形，大小均一，分散良好，均勻分布。HGNs的粒徑為51.6±7 nm，厚度為4.67±1.52 nm，紫外吸收光譜可見在780nm處有明顯的等離子共振吸收峰。利用異官能團的聚已二醇SH-PEG-COOH將HGNs與anti-TROP2抗體共價鍵連接，TEM照片顯示，偶聯(lián)上抗體的HGNs仍保持中空的圓球形形態(tài)，分布均勻，分散性良好，未見顆粒間明顯團聚粘連。疏水粒徑較HGNs有所增加，紫外吸收光譜可見最大吸收峰位置紅

15、移，從780nm移動到818 nm左右。
　　2.將濃度為0.3nM，1nM，2nM和3nM的HGNs作用于宮頸癌HeLa細胞3-48h，CCK8結(jié)果顯示HGNs未表現(xiàn)出明顯的毒性。
　　3.倒置顯微鏡下觀察HGNs與HeLa細胞共培養(yǎng)1小時后即能進入細胞，投射電鏡下觀察到明顯的膜樣結(jié)構(gòu)的吞噬泡形成。
　　結(jié)論:
　　1.本實驗成功制備了空心納米金球，共價鍵連接anti-TROP2抗體，細胞攝取anti-TROP