人胚胎干細胞傳代培養(yǎng)方法與其遺傳穩(wěn)定性的相關研究.pdf

1、人胚胎干細胞（HumanEmbryonicStemCells，hESCs）來源于胚胎發(fā)育過程中囊胚的內細胞團(InnerCellMass，ICM)。hESCs傳代過程中具有自身的特性，即，保持自我更新、增殖、自主分化以及多能性的特性。近些年，對于人胚胎干細胞的研究越來越受到科研學者的關注。
　　人胚胎干細胞研究的最終目的是應用于臨床醫(yī)學治療，但其安全性需要提前明確。探索hESCs的遺傳穩(wěn)定性對其安全性研究至關重要。胚胎干細胞的遺傳

2、穩(wěn)定性受到很多因素影響，例如，傳代方法，傳代時間等。隨著hESCs長期傳代培養(yǎng)，hESCs的遺傳穩(wěn)定性會出現發(fā)生改變。不同的傳代方法，包括機械法以及酶法傳代也會使其改變。傳統的G顯帶鑒定法最早應用于檢測hESCs的遺傳改變，近來，單核苷酸多態(tài)性（SNP，Singlenucleotidepolymorphism）芯片由于其更加精準的檢測被逐漸應用于hESCs。中華8芯片特別覆蓋中國人特有的常見和稀有變異，能夠精確地反應中國人的遺傳變異特點

3、。應用該芯片技術于中國人胚胎建立而成的干細胞系，可更有利于鑒定中國人干細胞的遺傳穩(wěn)定性變異。
　　本研究旨在探索適應于我中心hESCs的不同傳代方法，并且應用SNP芯片分析hESCs長期培養(yǎng)過程中基因遺傳的變化，最終為確認hESCs傳代過程的遺傳安全性提供理論依據及實踐基礎。本研究的主要創(chuàng)新點:.應用適合中國人遺傳變異的Omni中華8芯片，檢測利用中國人胚胎建立的人胚胎干細胞系的遺傳學變異。
　　目的
　　探索適應于我

4、中心人胚胎干細胞類型的不同傳代方法，以及長期傳代培養(yǎng)對其遺傳穩(wěn)定性的影響。
　　方法
　　1.利用鄭州大學第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學中心來源新鮮廢棄胚胎所建立的hESC系，均已經過全能性鑒定。采用傳統的機械傳代法，以及利用胰酶、Ⅳ型膠原酶法進行hESCs傳代培養(yǎng)，傳代后的hESCs種植于小鼠胚胎成纖維細胞和人包皮成纖維細胞按1∶1混合的飼養(yǎng)層上。
　　2.分別提取Zh2系P35/P60代的基因組DNA，應用高分辨率Omni中

5、華8芯片檢測人胚胎干細胞基因組DNA，分析其分子遺傳學變異。
　　結果
　　1.Ⅳ型膠原酶傳代法耗費時間較長，不宜掌控消化時間和接種密度;0.25％EDTA-胰蛋白酶消化hESCs成單細胞狀態(tài)，接種于飼養(yǎng)層后不利于繼續(xù)生長;機械法傳代可以根據需要切割成大小不同的團塊，并可以切除分化的或者狀態(tài)偏差的細胞，更加適合hESCs傳代。
　　2.利用中華8芯片對比我中心hESCs的Zh2-P35和Zh2-P60，可檢測出1130