急性ITP Th細胞極化狀態(tài)及PPAR-γ在Th細胞分化中的調節(jié)機制研究.pdf

1、[目的]
　　 1.探討急性ITP是否為Th1/Th2細胞失衡相關的自身免疫病。研究急性ITP患者外周血中Th細胞相關細胞因子INF-γ、IL-2、IL-10和IL-13的水平,Th細胞相關轉錄因子T-bet和GATA-3 mRNA的表達情況,探討急性ITP的Th細胞的偏移方向。
　　 2.探討急性ITP患兒外周血淋巴細胞PPAR-γ mRNA表達的變化與IL-2、IL-13的相關性,分析PPAR-γ在急性ITP發(fā)病機制

2、中對IL-2、IL-13的作用。
　　 3.探討配體活化的PPAR-γ對Jurkat T細胞NO/NOS表達的影響,分析其與調節(jié)Th1/Th2細胞失衡之間具體的作用機制。
　　 4.為臨床上治療急性ITP提供新的藥物和靶點提供理論依據(jù),并可能為臨床上治療其它Th1/Th2細胞分化失衡的自身免疫性疾病提供新的思路。
　　 [方法]
　　 1.外周血T淋巴細胞的分離
　　 取急性ITP患者及正常對照體

3、檢者外周靜脈血,枸椽酸鈉抗凝。淋巴細胞分離液常規(guī)分離外周血中單個核細胞,置玻璃培養(yǎng)皿中孵育去除單核細胞,加入NH4Cl溶液溶解紅細胞,經(jīng)T細胞分離富聚柱獲得純化的T細胞。加入10％新生牛血漿Hanks液重懸T細胞,調整T細胞濃度至2×106/ml。FITC標記的抗CD3單克隆抗體檢測其純度,臺盼藍拒染法檢測其活性。
　　 2.Th1/Th2相關細胞因子IL-2、IL-10、IL-13、INF-γ含量的檢測
　　 酶聯(lián)免疫

4、吸附試驗法(ELISA)測定血漿中INF-γ、IL-2、IL-10和IL-13的水平,按試劑盒說明書操作,用酶聯(lián)免疫檢測儀以450nm比色,測吸光度(OD)值,以標準曲線法計算樣本濃度,以pg/ml表示。
　　 3.PPAR-γ mRNA的檢測
　　 T淋巴細胞懸液抽提總RNA,一步法特異性擴增PPAR-γ mRNA,以β-actin為內參,瓊脂糖凝膠電泳RT-PCR的擴增產(chǎn)物,采用凝膠成像系統(tǒng)掃描PPAR-γ/β-ac

5、tin mRNA的條帶,測得條帶灰度值,以PPAR-γ/β-actin的灰度比值表示其mRNA表達的相對水平。
　　 4.PPAR-γ活化劑調節(jié)對NO/NOS的作用研究
　　 Jurkat T細胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)。PHA(5μg/ml)活化Jurkat T細胞24h后,調整細胞濃度為5×106/ml,培養(yǎng)于24孔細胞培養(yǎng)板。(1)時間效應:分成對照組和實驗組,每個實驗組和對照組設5個重復。實驗組加入20umol

6、/l藥物羅格列酮,對照組不加藥物,CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6h、12h、18h、24h和30h。(2)濃度效應:隨機分六組(對照組和1umol/l、5umol/l、10umol/l、15umol/l、20umol/l羅格列酮實驗組,每組設5個重復),對照組不加藥物,CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h。
　　 5.Jurkat T細胞培養(yǎng)液中NO水平的檢測
　　 收集細胞培養(yǎng)液離心沉淀,勻漿后取上清液,按照硝酸還原酶法測量NO含量。
　

7、　 6.Jurkat T細胞中NOS活性的測定
　　 嚴格按照一氧化氮合酶測定試劑盒說明書進行操作,最后測各管的吸光度值,利用計算公式計算出總NOS的活性。
　　 [結果]
　　 1.分離純化所得T淋巴細胞的純度和活性均大于95%。
　　 2.與正常對照組相比,急性ITP患者外周血INF-γ含量降低,IL-10含量升高;T-bet mRNA表達下降,而GATA-3 mRNA表達增強,Th1/Th2細胞因

8、子及相關轉錄因子表達比例明顯降低。
　　 3.急性ITP患兒外周血淋巴細胞PPAR-γ mRNA表達上升,血漿IL-2的含量顯著低于正常對照組、而IL-13的含量顯著高于正常對照組,PPAR-γ mRNA表達與血漿IL-2水平呈負相關,與IL-13水平呈正相關。
　　 4.在Jurkat系T細胞內,PPAR-γ活化劑能夠以時間和濃度依賴的形式增加NO生成,PPAR-γ活化劑能夠以相同的方式增加NOS活性。