一株HTLV-1病毒全基因組測序分析.pdf

1、背景與目的：
　　人嗜T淋巴細胞病毒(Human T-cell lymphotropic virus，HTLV)是第一個被發(fā)現(xiàn)的感染人的逆轉(zhuǎn)錄病毒。它存在有兩個亞型即HTLV-1和HTLV-2，它們之間在基因上的同源性高達70％。HTLV-2主要報道是愛斯基摩人感染;人T嗜淋巴細胞病毒Ⅰ型(HTLV-1)是一種能持續(xù)感染人類的外源性反轉(zhuǎn)錄病毒。在世界范圍內(nèi)，受其感染的包括日本、赤道附近非洲地區(qū)、加勒比海地區(qū)及南美洲地區(qū)約有1-2千

2、萬人;我國的東南沿海地區(qū)，如廣州、福建等地也存在小流行區(qū)。這種病毒的傳播途徑包括母嬰垂直傳播、性傳播、共用針頭傳播和污染血產(chǎn)品傳播。當(dāng)人一旦被HTLV-1感染后，病毒能夠在人體內(nèi)長期存在，潛伏期可長達20年以上，并可在多年后引起白血病或下肢癱瘓等致死或致殘性疾病。目前尚未研發(fā)出行之有效的治療藥物和病毒預(yù)防疫苗。
　　由于我國東南沿海地區(qū)存在一定數(shù)量的感染人群，又加之隨著經(jīng)濟的發(fā)展國內(nèi)人口流動行的加劇，以及HTLV-1傳播的特點和輸

3、血篩查項目的缺失。因而HTLV-1有可能在國內(nèi)傳統(tǒng)非流行區(qū)造成更多的感染者出現(xiàn)。為了深入探索我國傳統(tǒng)非流行區(qū)感染HTLV-1病毒基因的分子特征，我們在河南湖北大規(guī)模HTLV-1調(diào)查的基礎(chǔ)上，對獲得的一株HTLV-1病毒的全基因進行了測序和分析。
　　方法：
　　1.標(biāo)本的ELISA檢測:取100份健康人血清標(biāo)本和在湖北大規(guī)模HTLV-1調(diào)查得到的6份人類T淋巴細胞白血病病毒(HTLV)抗體檢測陽性的血清標(biāo)本，使雙抗原夾心酶聯(lián)

4、免疫法檢測復(fù)檢。
　　2.WB鑒定:雙抗原夾心酶聯(lián)免疫法檢測陽性的6份標(biāo)本，再使用新加坡MPBiomedicals Asia Pacific Pte.Ltd公司生產(chǎn)的MP Diagnostics(MPD)HTLVBLOT2.4的WB鑒定試劑檢測。
　　3.HTLV-1前病毒DNA分段擴增克隆和測序:提取HTLV-1陽性淋巴細胞得到的含有HTLV-1前病毒DNA的基因組，使用9對HTLV-1分段擴增引物分別進行PCR擴增，得到

5、9個相互重疊的HTLV-1片段;用T4連接酶使9個片段分別與T載體重組連接;采用PCR擴增和NcoⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定重組子;采用Sanger雙脫氧終止法進行正反雙向測序鑒定;測得的DNA序列采用Sequencher軟件3.1版(Genecodes，inc.，AnnArbor,MI，USA)進行拼接，得到全長HTLV-1前病毒基因組DNA序列。
　　4.分離株HTLV-1基因和蛋白進化樹分析。
　　結(jié)果：
　　1.雙

6、抗原夾心酶聯(lián)免疫法檢測結(jié)果顯示，100份健康人血清標(biāo)本均陰性;初檢陽性的血清標(biāo)本6份有5份陽性，1份位于臨界值。
　　2.使用新加坡MP Biomedicals Asia Pacific Pte.Ltd公司生產(chǎn)的MP Diagnostics(MPD)HTLV BLOT 2.4的WB鑒定試劑進行確認檢測，結(jié)果得到1例HTLV-1標(biāo)本。
　　3.HTLV-1前病毒DNA分段擴增結(jié)果:HTLV-1分段擴增得到1150bp的第一片段

7、、1149bp的第二片段、1135bp的第三片段、1087bp的第四片段、1045bp的第五片段、1050bp的第六片段、1136bp的第七片段、1148bp的第八片段和960bp第九片段，各片段大小與預(yù)計一致。
　　4.PCR擴增鑒定結(jié)果顯示9個片段均得到插入的陽性克隆。
　　5.9個重組克隆均能被NcoⅠ和SalⅠ雙酶切下對應(yīng)的插入序列，切下的插入序列的片段長度也與設(shè)計一致。
　　6.全長HTLV-1前病毒基因組D

8、NA序列（GenBank數(shù)據(jù)庫編號為KC807984）全長9034bp，其中“A”2088個占23.11％，“C”3159個占34.96％，“G”1707個占18.89％，“T”2080個占23.02％。其中，1-756位為5'端LTR區(qū);803-2092位為gag蛋白編碼區(qū);2499-5188位為pol蛋白編碼區(qū);5125-7128位為rex蛋白編碼區(qū);5181-8360位為tax蛋白編碼區(qū);5181-6647位為env蛋白編碼區(qū);8

9、279-9304位為3'端LTR區(qū)。
　　7.HTLV-1分離株KC807984全基因組進化分析結(jié)果顯示，其仍屬A組，親緣關(guān)系最近的是中國重慶分離株AF259264，它們基因序列同源性高達99.72％;與日本的幾個分離株(U19949，J02029，AB513134)同源性次之;與所羅門群島分離株親緣關(guān)系最遠，于中非分離株次之。
　　結(jié)論：
　　HTLV-1分離株KC807984全基因組9034bp，基因亞型屬A組，與