缺氧培養(yǎng)EPCs移植對(duì)缺血性心臟病的治療作用.pdf

1、目的：通過(guò)缺氧培養(yǎng)方法預(yù)處理骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞(BM-EPCs，bone marrow endothelial progenitor cells)，探討缺氧培養(yǎng)骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞（BM-HEPCs，hypoxic preconditioned bone marrow endothelial progenitor cells）心肌內(nèi)移植治療缺血性心臟病的治療效果及潛在的分子生物學(xué)機(jī)制，為臨床細(xì)胞移植治療缺血性心臟病提供理論依據(jù)和策略參考。

2、　　內(nèi)容：以BM-HEPCs為研究對(duì)象，觀察缺氧培養(yǎng)方法對(duì)大鼠BM-EPCs細(xì)胞生物學(xué)功能的影響和潛在的分子生物學(xué)機(jī)制；研究基質(zhì)細(xì)胞衍生因子－1α（SDF-1α，Stromal cell-derived factor-1α）/CXCR4（CXCR4，CXC receptor-4）信號(hào)通路在BM-HPECs中發(fā)揮的作用；探討B(tài)M-HPECs移植后對(duì)心室重構(gòu)、心臟功能和血流動(dòng)力學(xué)的影響；評(píng)估其對(duì)缺血性心臟病的治療效果。
　　方法：從8

3、周齡，體重250g～280g的同種系成年雄性Wistar大鼠長(zhǎng)骨分離獲得大鼠BM-EPCs，Dil標(biāo)記的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-acLDL，Dil-acetylated low-density lipoproteins)和異硫氰酸鹽熒光素標(biāo)記的荊豆凝集素-1（FITC-UEA-1，fluorescein isothiocyanate-lectin from ulex europaeus-1）共同染色陽(yáng)性，細(xì)胞表面白細(xì)胞分化抗原34（

4、CD，cluster of differentiation）/CD133表達(dá)陽(yáng)性。將37℃、5％CO2+21%O2條件下培養(yǎng)至第4天的BM-EPCs，隨機(jī)分為4組，第一組為常規(guī)培養(yǎng)組，37℃、5%CO2+21%O2條件下繼續(xù)培養(yǎng)3天；第二組為缺氧培養(yǎng)24h組，37℃、5%CO2+21%O2條件下繼續(xù)培養(yǎng)2天后，放入存滿1%O2+5%CO2+94%N2混合氣體的培養(yǎng)盒內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)1天；第三組為缺氧培養(yǎng)48h組，37℃、5%CO2+21%O2

5、條件下繼續(xù)培養(yǎng)1天后，放入存滿1%O2+5%CO2+94%N2混合氣體的培養(yǎng)盒內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2天；第四組為缺氧培養(yǎng)72h組，放入存滿1%O2+5%CO2+94%N2混合氣體的培養(yǎng)盒內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)3天，對(duì)以上各組細(xì)胞分別進(jìn)行抗凋亡檢測(cè)（Annexin V/PI），細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)(Boyden Chamber Assay)，血管分化功能檢測(cè)（Matrigel Assay），實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR，reverse transcript

6、ase-polymerase chain reaction）檢測(cè)CXCR4，磷酸化絲氨酸/蘇氨酸激酶（AKT，serine/threonine-specific protein kinase），磷脂酰肌醇3激酶（PI3K，phosphatidyl Inositol3-kinase）和核因子-κB(NF-κB，nuclear factor-κB)信使核糖核酸（mRNA，Messenger Ribonucleic Acid）表達(dá)水平，應(yīng)用蛋

7、白印跡實(shí)驗(yàn)（Western Blot）檢測(cè)細(xì)胞表面SDF-1α受體CXCR4，Akt，PI3K蛋白表達(dá)情況。比較各組細(xì)胞生物學(xué)功能變化差異。8周齡，體重250g～280g的同種系成年雄性Wistar大鼠34只，隨機(jī)分為3組：對(duì)照組（Control，n=12），EPCs組（n=10）和HEPCs組(n=12),左心耳下緣2mm處結(jié)扎前降支，建立急性心肌梗塞動(dòng)物模型。Control組：在心肌梗塞邊緣5個(gè)不同區(qū)域心肌內(nèi)注射PBS溶液200μl

8、；EPCs組：將2×106常規(guī)培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞稀釋于200μl PBS溶液中，在心肌梗塞邊緣5個(gè)不同區(qū)域心肌內(nèi)注射移植；HEPCs組：將2×106缺氧培養(yǎng)24h骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞稀釋于200μl PBS溶液中，在心肌梗塞邊緣5個(gè)不同區(qū)域心肌內(nèi)注射移植。4周后心臟超聲檢測(cè)心臟的形態(tài)學(xué)變化，壓力－容量曲線（P-V Loops，pressure-volume loops）分析評(píng)估實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血流動(dòng)力學(xué)和心臟功能變化。
　　結(jié)果：BM-EPCs隨培

9、養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),圓形或橢圓形細(xì)胞數(shù)目減少,梭形細(xì)胞數(shù)量增多,更換培養(yǎng)基后培養(yǎng)1天時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞集落,3天開(kāi)始出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞特異性條索狀結(jié)構(gòu)。分離培養(yǎng)至第7天的大鼠BM-EPCs，Dil-acLDL和FITC-UEA-1雙熒光染色細(xì)胞陽(yáng)性，CD34/CD133表達(dá)陽(yáng)性。隨缺氧處理時(shí)間延長(zhǎng)，BM-EPCs早期凋亡率明顯增加。與常規(guī)培養(yǎng)組相比，缺氧培養(yǎng)24 h組早期凋亡率改變不明顯（p>0.05），缺氧培養(yǎng)48 h組、72 h組，早期凋亡率明顯增加（p

10、<0.05）。以100ng/ml SDF-1α為趨化因子，比較常規(guī)條件和缺氧條件培養(yǎng) BM-EPCs的遷移能力，結(jié)果顯示缺氧培養(yǎng)24h組，大鼠BM-EPCs對(duì)SDF-1α的遷移明顯增加。隨缺氧處理時(shí)間的延長(zhǎng)，BM-EPCs體外血管形成能力變化明顯。與常規(guī)培養(yǎng)組比較，缺氧培養(yǎng)24 h組的體外血管形成能力增強(qiáng)（p<0.01），缺氧培養(yǎng)48 h，72 h組體外血管形成能力明顯下降（p<0.01）；與缺氧培養(yǎng)24 h組比較，缺氧培養(yǎng)48 h，7

11、2 h組體外血管形成能力明顯下降（p<0.05）。RT-PCR結(jié)果顯示，與常規(guī)培養(yǎng)組相比較，缺氧培養(yǎng)24h組CXCR4，AKT，PI3K和NF-κB表達(dá)均具有顯著差異(p>0.05)。缺氧培養(yǎng)大鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞24h，48h，72h后，Western Blot蛋白印跡實(shí)驗(yàn)顯示，細(xì)胞表面SDF-1α受體CXCR4表達(dá)水平增高，細(xì)胞內(nèi)相關(guān)通路蛋白AKT,PI3K表達(dá)水平增高。應(yīng)用ImageJ圖像處理軟件獲得蛋白印跡圖像密度灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析

12、，結(jié)果提示缺氧培養(yǎng)大鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞24h，48h，72h后，CXCR4，AKT，PI3K表達(dá)水平與普通培養(yǎng)組相比明顯增加，缺氧培養(yǎng)24h組與缺氧培養(yǎng)48h和72h相比較，蛋白表達(dá)增強(qiáng)，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)胞移植后4周，評(píng)估心臟形態(tài)及血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)。EPCs組左室舒張末期直徑和收縮末期直徑與對(duì)照組相比在移植后顯著下降(p<0.05),而最大壓力、左室內(nèi)壓與左室內(nèi)壓變化速率比（dP/dtmax，the maximum first

13、 derivative of developed left ventricle pressure），左室容量與左室容量變化速率比（dV/dtmax，the maximum first derivative of developed left ventricle volume），心搏量和每分輸出量以及射血分?jǐn)?shù)則明顯提高(p<0.05)。相比之下，HEPCs組左室舒張末期容積和收縮末期容積與對(duì)照組相比在移植后同樣下降明顯,且最大壓力、dP/

14、dtmax，dV/dtmax，心搏量和每分輸出量以及射血分?jǐn)?shù)則明顯提高。此外，HEPCs組左室收縮末期直徑與EPCs組相比下降明顯，最大壓力、dP/dtmax，左室射血分?jǐn)?shù)則明顯提高。
　　結(jié)論：1%O2+5%CO2+94%N2缺氧培養(yǎng)大鼠BM-EPCs24h為缺氧預(yù)處理的最佳條件，缺氧培養(yǎng)骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞上調(diào)細(xì)胞表面CXCR4，通過(guò)SDF-1α/CXCR4軸，PI3K/Akt細(xì)胞信號(hào)通路介導(dǎo)骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞增強(qiáng)發(fā)揮細(xì)胞生物學(xué)功效。H