microRNA-7調(diào)控胃癌惡性生物學(xué)行為的功能與分子機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　胃癌是我國乃至世界范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率均位居前列的惡性腫瘤。胃癌的發(fā)生是多種惡性生物學(xué)表型相互交織、相互影響、相互促進(jìn)的序貫過程，其本質(zhì)是細(xì)胞中分子事件從穩(wěn)態(tài)走向紊亂的總和。因此，研究胃癌發(fā)生過程中的關(guān)鍵分子事件，闡明其中的分子調(diào)控機(jī)制，將為胃癌臨床治療提供新的思路和方法。
　　微小 RNA（microRNA，miRNA）是近年發(fā)現(xiàn)的一類在真核細(xì)胞中發(fā)揮重要調(diào)控作用的內(nèi)源性非編碼RNA。miRNA通過與蛋白編碼基

2、因mRNA結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因表達(dá)，從而調(diào)控機(jī)體的生長發(fā)育和疾病發(fā)生過程。miRNA的調(diào)控特點(diǎn)在于其“一對(duì)多”的作用模式，即單個(gè)miRNA可通過堿基不完全互補(bǔ)配對(duì)方式抑制多個(gè)基因表達(dá)。此種調(diào)控方式可引起細(xì)胞內(nèi)大量分子相互作用關(guān)系和信號(hào)傳導(dǎo)通路改變，因此，miRNA被認(rèn)為是調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)行為的關(guān)鍵分子之一。
　　microRNA-7（miR-7）于2001年首次在果蠅中被發(fā)現(xiàn)。2008年以來，miR-7在腫瘤中的作用被陸續(xù)報(bào)道

3、，稱其在肝癌、肺癌和乳腺癌中表達(dá)降低，發(fā)揮抑癌基因的作用；近年來，亦有報(bào)道指出miR-7可促進(jìn)腎癌的發(fā)生?？梢姡琺iR-7在腫瘤中的功能與機(jī)制仍不明確。本實(shí)驗(yàn)室前期通過比對(duì)高、低轉(zhuǎn)移胃癌細(xì)胞系的miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn) miR-7在高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系中表達(dá)量顯著降低，提示其可能在胃癌發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌基因的作用。基于文獻(xiàn)報(bào)道和前期研究結(jié)果，本研究將進(jìn)一步聚焦miR-7，為闡明其在胃癌惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮的關(guān)鍵功能和調(diào)控機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)依

4、據(jù)。
　　目的：
　　1.明確miR-7與胃癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性。
　　2.明確miR-7在調(diào)控胃癌惡性生物學(xué)行為中所發(fā)揮的功能。
　　3.揭示miR-7在胃癌中發(fā)揮功能的分子生物學(xué)機(jī)制。
　　4.揭示miR-7在胃癌中表達(dá)失調(diào)的原因。
　　方法：
　　1.利用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)胃上皮細(xì)胞和胃癌細(xì)胞、胃癌新鮮組織標(biāo)本及其匹配的癌旁正常組織中miR-7的表達(dá)差異；利用原位雜交（ISH）技術(shù)檢測(cè)胃

5、癌組織芯片中miR-7的表達(dá)水平，并統(tǒng)計(jì)分析其與胃癌病理參數(shù)間的相關(guān)性。
　　2.合成miR-7的模擬物和抑制物，并構(gòu)建miR-7的過表達(dá)和shRNA干擾載體，分別通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定感染，建立 miR-7的功能獲得與功能缺失細(xì)胞模型；分別通過細(xì)胞生長曲線、平板集落形成實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)、裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)和裸鼠轉(zhuǎn)移瘤實(shí)驗(yàn)等方法，研究上、下調(diào) miR-7對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等惡性

6、生物學(xué)行為的影響。
　　3.聯(lián)合運(yùn)用cDNA基因芯片技術(shù)和蛋白組學(xué)iTRAQ技術(shù)，分別在胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組兩個(gè)層次，高通量篩選過表達(dá) miR-7后的差異表達(dá)基因，并結(jié)合生物信息學(xué)方法，篩選差異表達(dá)基因中的 miR-7直接作用靶分子；采用雙螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，驗(yàn)證 miR-7與候選靶分子間的相互作用關(guān)系；在胃癌細(xì)胞中上調(diào)或下調(diào)miR-7后，利用蛋白印跡（Western blot）和實(shí)時(shí)定量PCR方法分別檢測(cè)候選靶分子的表達(dá)

7、變化；通過功能實(shí)驗(yàn)和功能挽救實(shí)驗(yàn)，分別驗(yàn)證 miR-7的靶分子在胃癌惡性生物學(xué)行為中所發(fā)揮的功能以及 miR-7通過調(diào)控這一靶分子對(duì)胃癌惡性生物學(xué)行為的影響。
　　4.通過生物信息學(xué)方法，預(yù)測(cè)miR-7啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)；通過上調(diào)或下調(diào)這一轉(zhuǎn)錄因子，采用實(shí)時(shí)定量 PCR方法檢測(cè) miR-7初始轉(zhuǎn)錄本（primary miR-7，pri-miR-7）的表達(dá)變化；利用染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)，在胃癌細(xì)胞中驗(yàn)證此轉(zhuǎn)錄因

8、子與miR-7啟動(dòng)子的結(jié)合情況；在胃癌細(xì)胞中上調(diào)或下調(diào)miR-7，分別利用免疫熒光和實(shí)時(shí)定量PCR方法，檢測(cè)miR-7對(duì)此轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)和定位，以及其下游效應(yīng)分子表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　1.實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，與正常胃上皮細(xì)胞相比，miR-7在胃癌細(xì)胞中表達(dá)降低，且在高轉(zhuǎn)移胃癌細(xì)胞中表達(dá)進(jìn)一步降低；與癌旁正常組織相比，miR-7在胃癌組織中的表達(dá)降低，且在胃癌轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)較原發(fā)灶進(jìn)一步降低；組織芯片 ISH結(jié)果表明

9、，miR-7在大多數(shù)胃癌臨床標(biāo)本中呈低表達(dá)，其表達(dá)水平與胃癌分級(jí)和分期呈負(fù)相關(guān)，與胃癌患者生存期呈正相關(guān)，并可作為判斷胃癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　2.實(shí)時(shí)定量 PCR結(jié)果表明，通過轉(zhuǎn)染和感染 miR-7的模擬物和抑制物，以及miR-7的過表達(dá)載體和shRNA干擾載體，能夠有效上、下調(diào)miR-7在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)水平；細(xì)胞生長曲線、平板集落形成實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)表明，miR-7能夠抑制胃癌細(xì)胞的體外生長過程；通過流式細(xì)胞術(shù)檢

10、測(cè)細(xì)胞周期，結(jié)果表明miR-7能夠抑制胃癌細(xì)胞周期進(jìn)展；通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果表明 miR-7能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞早期凋亡；Transwell遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-7能夠抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力；裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-7能夠抑制胃癌細(xì)胞的體內(nèi)生長過程；裸鼠轉(zhuǎn)移瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-7能夠抑制胃癌細(xì)胞形成轉(zhuǎn)移灶的能力。
　　3.在胃癌細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-7后，聯(lián)合運(yùn)用cDNA基因芯片、iTRAQ技

11、術(shù)和生物信息學(xué)方法，在全基因組的mRNA和蛋白水平高通量篩選出下調(diào)的差異表達(dá)基因分別為180個(gè)和75個(gè)，其中重點(diǎn)關(guān)注miR-7對(duì)RELA、FOS和IGF1R等與腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移表型密切相關(guān)基因的調(diào)控；雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明，miR-7能夠直接結(jié)合RELA、FOS和IGF1R的3’末端非編碼區(qū)（3’-untranslated region，3’-UTR）上的結(jié)合位點(diǎn)；實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot結(jié)果表明，miR-7與RE

12、LA和FOS的mRNA和蛋白表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)，但其與IGF1R的負(fù)相關(guān)關(guān)系僅存在于蛋白水平；通過上調(diào)或下調(diào)RELA和FOS的功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RELA和FOS能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖，抑制胃癌細(xì)胞凋亡；功能挽救實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-7能夠通過調(diào)控 RELA和FOS抑制胃癌增殖；進(jìn)一步機(jī)制研究表明，miR-7可通過負(fù)向調(diào)控IKKε抑制RELA的激活；通過上調(diào)或下調(diào)IGF1R的功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IGF1R能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移；功能挽救實(shí)驗(yàn)結(jié)

13、果表明，miR-7能夠通過調(diào)控 IGF1R抑制胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移；進(jìn)一步機(jī)制研究表明，miR-7可通過抑制IGF1R，降低Snail的表達(dá)，間接促進(jìn)E-cadherin的表達(dá)，抑制胃癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程。
　　4.實(shí)時(shí)定量 PCR結(jié)果表明，在胃上皮細(xì)胞中過表達(dá) IKKε和RELA可抑制pri-miR-7的表達(dá)，在胃癌細(xì)胞系中干擾IKKε和RELA可促進(jìn)pri-miR-7的表達(dá)；通過生物信息學(xué)方法，預(yù)測(cè)到人類基因組中mi

14、R-7的3個(gè)編碼基因的啟動(dòng)子區(qū)域共存在7簇NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)；ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RELA能夠與miR-7-1和-2基因的啟動(dòng)子區(qū)域相結(jié)合；免疫熒光結(jié)果表明，過表達(dá)miR-7可抑制IKKε和RELA的表達(dá)，并能夠抑制RELA的核轉(zhuǎn)位；實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，過表達(dá)miR-7可抑制NF-κB信號(hào)通路下游多個(gè)效應(yīng)分子的表達(dá)；啟動(dòng)子報(bào)告基因和實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，幽門螺桿菌感染能夠上調(diào)NF-κB轉(zhuǎn)錄活性，并抑制pri-miR-7的表達(dá)。

15、
　　結(jié)論：
　　本研究明確了miR-7在胃癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)模式，揭示了miR-7表達(dá)降低與胃癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)性；明確了miR-7在調(diào)控胃癌惡性生物學(xué)行為中所發(fā)揮的功能，表明其在胃癌中起到抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡和抑制轉(zhuǎn)移的作用；揭示了miR-7/IKKε/RELA和miR-7/IGF1R/Snail兩條分子通路分別影響胃癌增殖和轉(zhuǎn)移表型的分子機(jī)制；揭示幽門螺桿菌感染導(dǎo)致NF-κB分子通路過度激活對(duì)miR-7在胃癌中表達(dá)降