腺病毒介導(dǎo)基因修飾MSCs抗腫瘤及白血病干細(xì)胞研究.pdf

1、目的:構(gòu)建攜帶綠色熒光蛋白的TNFa-Tumstatin融合基因腺病毒表達(dá)載體(AdGFP/TNFa-Tumstatin)，轉(zhuǎn)染人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)，研究融合基因TNFa-Tumstatin修飾的hUCMSCs體外通過分泌TNFa-Tumstatin融合蛋白發(fā)揮的抗腫瘤效應(yīng)；本文還開展了體外培養(yǎng)髓系白血病干細(xì)胞(leukemia ste

2、m cells，LSC)并鑒定其特征的初步研究。 方法:設(shè)計含有GM-CSF信號肽序列和BglⅡ及HindⅢ酶切位點的引物，PCR擴增TNFa-Tumstatin，將擴增產(chǎn)物亞克隆到帶有GFP標(biāo)記的pAdTrack-CMV穿梭質(zhì)粒上。重組穿梭質(zhì)粒經(jīng)Pme Ⅰ性化后轉(zhuǎn)化含有腺病毒骨架質(zhì)粒的BJ5183中同源重組，篩選獲得含有融合基因的重組腺病毒質(zhì)粒，酶切鑒定并測序。同時構(gòu)建不含目的基因的空重組腺病毒表達(dá)載體作為對照。重組病毒質(zhì)粒用

3、Pac Ⅰ酶切線性化，用磷酸鈣轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，經(jīng)過包裝、擴增后感染人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞，然后分別用RT-PCR、流式細(xì)胞儀、EIJSA、MTT法及LDH釋放法等方法鑒定融合基因及蛋白的表達(dá)，評價TNFa-Tumstatin修飾的hUCMSCs的抗腫瘤活性；體外培養(yǎng)急性髓系白血病患者的骨髓單個核細(xì)胞，觀察其形態(tài)學(xué)特征、長期存活及增殖特性，采用染色體分析和流式分析技術(shù)研究其核型和細(xì)胞表面標(biāo)志，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)分析其nucleostemin

4、、Bmi-1、ABCG2、prominin1、OCT4、Nanog等干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)。 結(jié)果:PCR和酶切分析的結(jié)果表明成功地構(gòu)建了攜帶有目的基因的重組腺病毒載體，測序結(jié)果證實與設(shè)計片斷的序列一致。Pac Ⅰ線性化后采用磷酸鈣方法轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，可見GFP表達(dá)，裂解細(xì)胞，收獲病毒，可反復(fù)感染293A細(xì)胞。將包裝好的病毒感染hUCMSCs，24h后可見GFP表達(dá)，隨著時間延長，GFP表達(dá)明顯增強，72h感染效率大于90％。R

5、T-PCR結(jié)果表明融合基因在細(xì)胞中表達(dá)，ELISA結(jié)果證實細(xì)胞表達(dá)并分泌融合蛋白。培養(yǎng)上清液能抑制ECV-304細(xì)胞的增殖和殺傷白血病細(xì)胞U937、THP-1；在另外的研究中，從急性髓系白血病患者骨髓單個核細(xì)胞中，培養(yǎng)出一株長期傳代細(xì)胞，能夠在體外12個月以上存活并保持其增殖特性，呈集落樣懸浮生長，染色體核型為亞四倍體，細(xì)胞表達(dá)CD38、CD29、CD44和HLA-DR，弱表達(dá)CD19和CD71，不表達(dá)CD34、CD13、CD2和CD1

6、05，能夠表達(dá)nucleostemin、Bmi-1、ABCG2、prominin1、OCT4和Nanog等基因。 結(jié)論:成功構(gòu)建了TNFa-Tumstatin融合基因的腺病毒表達(dá)載體(AdGFP/TNFa-Tumstatin)，高效轉(zhuǎn)染hUCMSCs，TNFa-Tumstatin融合基因修飾的hUCMSCs能表達(dá)和分泌融合蛋白，有效地發(fā)揮體外抗腫瘤的作用；經(jīng)長期培養(yǎng)所獲得的一株白血病細(xì)胞，具備了白血病干細(xì)胞的一些特征，為從白血病