單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)新方法研究.pdf

1、后基因組時代，以核酸、蛋白質(zhì)、代謝物以及它們之間相互作用網(wǎng)絡(luò)為對象的各種“組學(xué)”研究，已經(jīng)成為發(fā)現(xiàn)生命的化學(xué)基礎(chǔ)和加速人們對其分子機制更加深入了解的主要工具。尤其是最年來，癌癥和干細胞等領(lǐng)域的重大突破揭示了群體細胞中某些細胞在功能上表現(xiàn)出的異質(zhì)性，對“組學(xué)”研究向單細胞水平延伸提出了明確的需求，催生了多種單細胞分析方法產(chǎn)生和快速發(fā)展，例如，微流控芯片、流式細胞術(shù)、質(zhì)譜、拉曼光譜等高靈敏度、高通量和高分辨率的分析手段，為單細胞基因組、單細

2、胞蛋白質(zhì)組和單細胞代謝組等單細胞組學(xué)研究提供了強大的研究手段。
　　流式細胞術(shù)和化學(xué)細胞術(shù)是單細胞蛋白質(zhì)組研究的兩大核心技術(shù)?；谧罱l(fā)展起來的基于活性的熒光探針（ABP, Activity-Based Probe）技術(shù)，本文提出一種新的單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)（Single-cell proteomics）分析方法，將流式細胞術(shù)功能性標記理念與化學(xué)細胞術(shù)的單細胞全局蛋白質(zhì)組分析理念相結(jié)合，從功能入手，建立了單細胞功能蛋白質(zhì)組研究新策略。

3、基于該策略，構(gòu)建了達到單細胞檢測水平的毛細管電泳-激光誘導(dǎo)熒光系統(tǒng)，并結(jié)合ABP探針的特異性和熒光報告特性，對細胞表面低豐度的膜受體蛋白家族（GABAB受體）和細胞器內(nèi)的難以標記的蛋白酶（半胱氨酸組織蛋白酶）進行單細胞蛋白質(zhì)組分析。主要工作內(nèi)容如下：
　　（1）發(fā)展了高分辨率、高靈敏度、適用于單細胞分析的毛細管電泳-激光誘導(dǎo)熒光裝置。構(gòu)建了單細胞進樣裝置，能夠精準地將單個目標細胞導(dǎo)入毛細管中，并驗證了系統(tǒng)的可靠性；利用聚丙烯酰胺等

4、對毛細管內(nèi)壁進行了共價修飾，以防止蛋白質(zhì)吸附并提高分離效率，對分子量標記蛋白質(zhì)進行分離表明，其分辨率達到了文獻報道的最好水平；采用熒光素樣品，證實了本系統(tǒng)的檢測限為4×10-12M；對毛細管區(qū)帶電泳和毛細管篩分電泳兩種電泳模式，都獲得了較高的重現(xiàn)性。
　?。?）基于上述平臺，發(fā)展了一種基于ABP的單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)新方法，并詳細研究了細胞膜表面低豐度GABAB家族功能性蛋白質(zhì)組表達。ABP探針在分子結(jié)構(gòu)上由串聯(lián)的3個功能域(ABC)

5、構(gòu)成：A域為向?qū)^(qū)，通過識別靶蛋白質(zhì)與其形成非共價結(jié)合；B域為錨定區(qū)，通過點擊化學(xué)將該分子共價結(jié)合在靶蛋白質(zhì)上；C域為指示區(qū)，為高靈敏的熒光分子結(jié)構(gòu)。通過ABP探針，可以高選擇性地實現(xiàn)單細胞上指定的蛋白質(zhì)群的功能化標記；標記的細胞再通過單細胞毛細管電泳獲得單細胞功能性蛋白質(zhì)組表達譜。為驗證該方法的可靠性，首先獲得了單個HEK細胞的GABAB1(GB1)-like蛋白質(zhì)組表達譜，通過對比過量表達GB1的HEK細胞蛋白質(zhì)表達譜和蛋白質(zhì)分子量

6、譜，確認了GB1在圖譜中的位置；在單細胞水平，對比了GB1在HEK、MEF和CHO等不同細胞系之間以及同一MEF細胞系內(nèi)不同細胞之間的表達結(jié)果，發(fā)現(xiàn)不同細胞系之間或同一細胞系不同細胞之間差異明顯；將上述方法應(yīng)用于小鼠原代顆粒神經(jīng)元細胞(CGN)的GB1表達分析，發(fā)現(xiàn)同源細胞群體內(nèi)部的細胞異質(zhì)性，進一步的GB1拮抗劑和激活劑的藥物競爭性實驗證實了結(jié)果的可靠性。
　?。?）對于細胞胞質(zhì)、甚至細胞器內(nèi)的各種酶類而言，細胞膜成為了阻礙活性

7、探針進入細胞并標記它們的第一道屏障。針對半胱氨酸組織蛋白酶的，設(shè)計能夠透過細胞膜的ABP探針，用活細胞實時熒光成像的方法確定了探針孵育、恢復(fù)時間等細胞標記的關(guān)鍵參數(shù)。基于該ABP探針和單細胞功能蛋白質(zhì)組分析新策略，研究了單個細胞水平半胱氨酸組織蛋白酶的表達譜。并對比了群體細胞水平半胱氨酸組織蛋白酶PAGE檢測及質(zhì)譜鑒定結(jié)果，證實了結(jié)果的可靠性。
　　綜上所述，本文發(fā)展的單細胞功能性蛋白質(zhì)組學(xué)新方法既能夠研究細胞膜表面的低豐度表面膜