變應(yīng)性鼻炎及其合并哮喘者差異基因表達(dá)譜的研究.pdf

1、據(jù)文獻(xiàn)報道約1/3的變應(yīng)性鼻炎患者與支氣管哮喘常同時或先后出現(xiàn)，部分患者先有鼻炎，數(shù)年后出現(xiàn)哮喘，部分患者鼻炎和哮喘基本同時出現(xiàn)，部分患者先有哮喘，而后出現(xiàn)鼻炎，后者多見于兒童。近年來對AR與哮喘的發(fā)病機(jī)制中基因調(diào)控問題的深入研究，使人們逐步認(rèn)識到AR合并哮喘的發(fā)生受到多種因素的調(diào)控，是多種生物分子和信號通路在時間和空間上復(fù)雜作用的結(jié)果，但傳統(tǒng)的研究方法一次只能檢測一個或幾個基因，不僅費時、效率低，而且可比性亦較差。上世紀(jì)90年代中期發(fā)

2、展起來的高通量的基因芯片技術(shù)可同時對數(shù)以萬計的基因進(jìn)行快速而準(zhǔn)確的檢測，有效避免和彌補(bǔ)了傳統(tǒng)技術(shù)的不足，結(jié)果客觀可信。其中的表達(dá)譜芯片是應(yīng)用最為廣泛的基因芯片?；诖?，本研究利用Affymetrix公司的人類全基因組芯片HU-U133-PLUS 2.0對SAR及SAR合并哮喘患者鼻黏膜行差異基因表達(dá)譜的研究，并將其作為研究變應(yīng)性鼻炎并發(fā)哮喘的基因調(diào)控機(jī)制的重要切入點。 研究分為兩部分，主要結(jié)果和內(nèi)容如下： 一、基因芯片構(gòu)

3、建及篩查變應(yīng)性鼻炎(AR)及其合并哮喘者的基因表達(dá)譜 1.選擇基因芯片待檢測標(biāo)本(AR及AR合并哮喘者下鼻甲黏膜)及標(biāo)本的總RNA提取、質(zhì)檢 嚴(yán)格按照變應(yīng)性鼻炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)采用1997年?？跁h制定的標(biāo)準(zhǔn)<'[1]>；支氣管哮喘的診斷標(biāo)準(zhǔn)采用1997年制定的“支氣管哮喘防治指南”的診斷標(biāo)準(zhǔn)<[2]>；選取臨床病例。同時RIZOL法提取SAR及SAR合并哮喘下鼻甲黏膜的總RNA，經(jīng)1.2％甲醛變性膠電泳鑒定RNA完整性，試劑

4、盒純化RNA。結(jié)果表明入選臨床病例均符合相關(guān)疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)且為特應(yīng)性體質(zhì)。RNA甲醛電泳顯示28S、18S兩條rRNA條帶，且28S明顯亮于18S，OD260/OD280≥2.0，表明從下鼻甲黏膜標(biāo)本中成功提取RNA。 2.Affmetrix基因芯片技術(shù)研究變應(yīng)性鼻炎及其合并哮喘者的表達(dá)譜 將下鼻甲標(biāo)本的RNA反轉(zhuǎn)錄為雙鏈cDNA，再次轉(zhuǎn)錄為cRNA并以生物素標(biāo)記和片段化，與預(yù)制的Affymetrix人基因組U133Plu

5、s2.0(GeneChip Human U133Plus2.0)基因芯片雜交、并進(jìn)行芯片掃描和分析，部分差異基因用實時RT-PCR驗證結(jié)果。發(fā)現(xiàn)在所有檢測54675個探針(47，000個轉(zhuǎn)錄本)中，SAR標(biāo)本檢測到24924個轉(zhuǎn)錄本，表達(dá)基因檢出率為45.2％,SAR合并哮喘標(biāo)本檢測到22002個轉(zhuǎn)錄本，表達(dá)基因檢出率為40.2％，兩張芯片表達(dá)基因檢出率均在40％～50％之間，在哺乳動物中，一般認(rèn)為在正常的細(xì)胞活動中，只有不到50％的基

6、因是表達(dá)的。對于全基因組規(guī)模的表達(dá)譜基因芯片，一般能檢測到40-50％基因是有表達(dá)的，表明芯片檢測的靈敏度很高。Signal Log Ratio欄中的值≥1或≤-1，代表信號強(qiáng)度之間的差異至少2倍。本研究設(shè)定差異至少2倍以上有意義，可得差異表達(dá)的基因共有1900個，其中有849個基因，表達(dá)上調(diào)，1051個表達(dá)下調(diào)。 二、對SAR極其SAR合并哮喘者差異基因行分子生物信息學(xué)分析 1.SAR及其合并哮喘者差異基因的G0功能分

7、類和生物通路(pathway)分析 利用GeneSpring軟件，依據(jù)Gene Ontology數(shù)據(jù)庫對AR及其合并哮喘者的2倍以上、4倍以上差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分類；依據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫、GenMapp數(shù)據(jù)庫分別對2倍以上差異基因及差異最顯著的前十個基因行生物通路pathway分析。 2.鼻黏膜SCCA1、SCCA2表達(dá)水平有望成為變應(yīng)性鼻炎并發(fā)哮喘的相關(guān)生物標(biāo)記 對差異表達(dá)基因結(jié)合GeneCard數(shù)據(jù)庫、pub

8、med-NLM文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘(datamining)。結(jié)果顯示在GeneCard數(shù)據(jù)庫中查到與哮喘相關(guān)基因354個，變應(yīng)性鼻炎相關(guān)基因45個，變應(yīng)性哮喘(allergic asthma)相關(guān)基因13個，結(jié)合芯片差異表達(dá)基因和pubmed-NLM文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫示鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原SCCA1(SERPINB3)、SCCA2(SERPINB4)表達(dá)升高與SAR并發(fā)哮喘相關(guān)。 以上研究結(jié)果表明SAR合并哮喘的發(fā)生和發(fā)展，存在多基因表

9、達(dá)調(diào)控的改變，對其差異基因表達(dá)譜的研究有助于闡明變應(yīng)性鼻炎合并哮喘的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，并有利于發(fā)現(xiàn)一些未知的與新基因功能潛在相關(guān)的信號通路，另外對成人SAR和SAR合并哮喘者的差異基因表達(dá)譜的構(gòu)建以及相關(guān)信號傳導(dǎo)通路的逐漸明晰，為成人SAR與SAR合并哮喘基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫和AR相關(guān)疾病基因網(wǎng)絡(luò)學(xué)說的建立提供了重要的數(shù)據(jù)。 評估基因芯片檢測結(jié)果的可靠性及其價值，除了從靶樣品的質(zhì)量與數(shù)量、芯片檢測與驗證技術(shù)、數(shù)據(jù)挖掘策略與方法三個方面來考