ApoG2對乳腺癌MCF-7細胞放射增敏作用及與紫杉醇聯合應用協同效應的實驗研究.pdf

1、研究背景:
　　 乳腺癌是目前威脅婦女生命健康常見的惡性腫瘤之一。我國是乳腺癌發(fā)病率增長較快的國家之一，中國抗癌協會公布的統計數字顯示，我國近年來乳癌發(fā)病率正以每年3％的速度增加，成為城市中死亡率增長較快的腫瘤;除此之外，患者的發(fā)病年齡呈逐漸年輕化的趨勢。盡管治療上近幾年取得較大的進展，但是仍然有較多的患者在治療中(后)出現轉移、復發(fā)。因此深入研究乳腺癌的發(fā)病機制，尋找更有效治療乳腺癌的方法是必要的。
　　 化療作為治療

2、乳腺癌的重要手段，但在治療的同時，其副作用也是不容忽視的。例如:骨髓抑制，消化道反應，免疫功能降低，抗感染能力下降，皮膚、粘膜損害，神經系統的損傷等，當患者不能耐受時，將嚴重影響治療效果。對于放療，無論是術前放療或術后放療均可降低局部復發(fā)率和提高總生存率;在乳腺癌綜合治療過程中，放射治療已經成為治療腫瘤的重要手段。但在臨床應用中多種因素會影響放療的效果。包括腫瘤細胞本身的放射敏感性以及腫瘤對放射線的抵抗，而腫瘤周邊正常組織又限制了放射劑

3、量的增加，嚴重影響放療的療效。因此如何克服腫瘤的放射抗性，提高腫瘤的放射敏感性已成為人們關注和研究的課題。目前使用放射增敏劑來提高放療效果已經成為研究的熱點。放射增敏劑是指通過應用化學或生物手段來增加腫瘤細胞對放療的敏感性.但同時又不明顯增加對正常組織的毒性，一個理想的放射增敏劑，應當滿足以下六點要求:
　　 ①對正常組織細胞不增敏，但能對腫瘤細胞增敏;
　　 ②對正常組織無毒性或毒性很小;
　　 ③具有理想的脂

4、水分配系統，能透入腫瘤細胞或乏氧區(qū)，不分布或少量分布到易引起毒性反應的正常組織部位;
　　 ④化學性質較穩(wěn)定，生物半衰期適當;
　　 ⑤在整個細胞的周期中都有效;
　　 ⑥治療中，較低的藥物劑量即可起到放射增敏作用。
　　 紫杉醇是從紫衫(紅豆杉)樹皮中提取的一種抗癌藥，是紅豆杉屬植物中的一種復雜的次生代謝產物，也是目前所了解的惟一一種可以促進微管聚合和穩(wěn)定已聚合微管的藥物。同位素示蹤表明，紫杉醇只結合到

5、聚合的微管上，不與未聚合的微管蛋白二聚體反應。接觸紫杉醇后，細胞內會積累大量的微管，這些微管的聚集干擾了細胞功能，特別是使細胞分裂停止于有絲分裂期，阻斷了細胞的正常分裂。紫杉醇主要適用于卵巢癌和乳腺癌，對肺癌、大腸癌、黑色素瘤、頭頸部癌、淋巴瘤、腦瘤也具有一定療效;但存在明顯劑量限制性毒性，給臨床應用帶來一定的局限性。
　　 棉酚(gossypol)系存在于錦葵科棉屬植物棉花的種子、葉、莖及根部等器官中的一種含量較高的黃色多元酚

6、類化合物，是Bcl-2的小分子抑制劑。研究表明，棉酚的活性成分是左旋棉酚，其主要作用于Bcl-2/Bcl-xl基因，阻止其與促凋亡基因如Bak、Bax、Bad等結合形成異源二聚體，從而引起腫瘤細胞發(fā)生凋亡。在體內和體外實驗中，棉酚均表現出有效的抗腫瘤活性。Apogossypolone(ApoG2)是棉酚的一種新型衍生物，其毒性低，副作用小，腫瘤殺傷效果好。對腫瘤細胞生長的抑制作用較左旋棉酚強，顯示出更好的發(fā)展前景。本研究以人乳腺癌MCF

7、-7細胞系為對象，研究ApoG2與放療，化療聯合的協同效應，并探討可能的作用機制，為乳腺癌治療提供一些新的研究方向。
　　 研究目的:
　　 本實驗以高表達Bcl-2的乳腺癌細胞株MCF-7為對象，研究ApoG2對人乳腺癌細胞系MCF-7的放射增敏作用，及與紫杉醇聯合應用的協同效應，并初步探討其可能的作用機制，為ApoG2的進一步研究及臨床應用提供實驗依據，奠定理論基礎。
　　 實驗方法:
　　 1.采用

8、 MTT體外增殖法研究ApoG2，單純照射組及兩者聯合作用72h對乳腺癌細胞系MCF-7的體外增殖抑制作用，并計算q值大小;
　　 2.MTT法檢測紫杉醇、ApoG2單藥及兩者聯合作用48h對MCF-7細胞的毒性，并計算CDI(兩藥相互作用指數);
　　 3.采用平板克隆形成分析法計算各組細胞存活分數SF，通過“多靶單擊數學模型”擬合細胞存活曲線，并觀察(2、4、6、8Gy)單純照射及(2.5、5μmol/L) ApoG

9、2+(2、4、6、8Gy)照射組對腫瘤細胞的殺傷作用;
　　 4.放射敏感性實驗細胞分組1:(對照組、5μmol/LApoG2組、8 Gy射線組、5μmol/LApoG2+8 Gy射線組)，化療敏感性實驗細胞分組2:(對照組、10μmol/LApoG2組、0.25μmol/紫杉醇組、10μmol/LApoG2+0.25μmol/L紫杉醇組)。用Hoechst33258熒光染色法及AO熒光染色法觀察MCF-7細胞在上述分組處理作用

10、48h后引起的凋亡和自噬形態(tài)學的變化;
　　 5.流式細胞儀分析經上述分組處理的MCF-7細胞的凋亡率及自噬熒光強度變化;
　　 6.Western blot法檢測經上述分組處理的MCF-7細胞Bcl-2蛋白及Beclinl蛋白表達變化。
　　 實驗結果:
　　 1.通過 MTT體外增殖實驗檢測提示ApoG2、射線對MCF-7細胞系分別作用72h后具有生長增殖抑制作用(FApoG2＝197.338，P＝0

11、.000; F射線=647.817，P=0.000)，兩者聯合作用72h后，抑制率隨著藥物濃度及射線劑量的增加逐漸增強，兩者之間存在交互效應(F=15.200，P=0.000)。通過計算q＞1.15，ApoG2與射線聯合應用具有協同作用。不同濃度ApoG2、紫杉醇對 MCF-7細胞分別作用48h后具有生長抑制作用(FApoG2=156.916，P=0.000;Fpaclitaxel=129.904，P=0.000)，兩者聯合作用48h后

12、，抑制率隨著兩者藥物濃度的增加逐漸增強，兩者之間存在交互效應(F=12.402，P=0.000)。通過計算CDI＜1，ApoG2與紫杉醇聯合應用具有協同效應。
　　 2.平板克隆實驗表明，經射線(2，4，6，8Gy)、(2.5，5μmol/L) ApoG2+射線(2，4，6，8Gy)作用于乳腺癌細胞MCF-7細胞2周后，單純照射組、2.5μmol/L+照射組和5μmol/L+照射組的細胞存活率隨著射線劑量的增加逐漸降低，差異具有

13、統計學意義(F單純照射=264.308，P單純照射=0.000;F2.5μmol/L+照射＝180.204，P2.5μmol/L+照射=0.000;F5μmol/L+照射＝214.737，P5 mol/L+照射=0.000)。通過單擊多靶模型擬合曲線顯示:單純照射組Do、Dq分別為1.925，3.564Gy，2.5μmol/L ApoG2+照射組Do、Dq、SER(Do值比)、SER(Dq值比)分別為1.688 Gy，2.123 Gy，

14、1.140，1.679，5μmol/LApoG2+照射組Do、Dq、SER(Do值比)、SER(Dq值比)分別為1.317Gy，1.675Gy，1.462，2.128。低濃度的ApoG2作用后Do、Dq均低于對照組。實驗組曲線低劑量區(qū)“肩區(qū)”明顯縮小變窄，且各劑量點的存活分數均低于對照組，提示細胞亞致死性放射損傷修復能力降低。
　　 3.Hoechst33258熒光染色法可見5μmol/LApoG2、8 Gy射線及兩者聯合作用于

15、MCF-7細胞48h，10μmol/LApoG2、0.25μmol/紫杉醇及兩者聯合作用48h后，熒光顯微鏡下可見核固縮、碎裂，染色質凝集、凋亡小體形成等凋亡現象;而對照組細胞則呈現彌散均勻，淡藍色的正常細胞核。ApoG2與紫杉醇聯合作用組較單獨處理組凋亡現象更明顯，而ApoG2與射線聯合組較單獨處理組比較凋亡現象未見明顯增加;AO(吖啶橙)熒光染色法可見對照組細胞胞漿或胞核染成亮綠色熒光，處理組胞漿或胞核可見亮紅色熒光，為酸性自噬泡，

16、聯合作用組較單獨處理組自噬現象更明顯。
　　 4.流式細胞檢測技術可見5μmol/LApoG2，8Gy射線及兩者聯合作用于MCF-7細胞48h后，不同處理組凋亡率差異具有統計學意義(F=35.074，P=0.000);不同處理組自噬熒光強度差異具有統計學意義(F=470.809，p＝0.000)。聯合作用組細胞自噬熒光強度較單獨處理組升高(P＜0.05)，但聯合作用組凋亡率較單獨處理組并不都具有統計學意義。10μmol/LApo

17、G2，0.25μmol/L紫杉醇及兩者聯合作用于MCF-7細胞48h后，不同處理組凋亡率差異具有統計學意義(F=571.563，P＝0.000);不同處理組自噬熒光強度差異具有統計學意義(F=204.422，P=0.000)。聯合作用組細胞凋亡率和自噬熒光強度均較單獨處理組升高(P＜0.05)。
　　 5.Western blot檢測結果提示5μmol/LApoG2，8Gy射線及兩者聯合作用于MCF-7細胞48h后，不同處理組B

18、eclinl，Bc1-2蛋白表達差異具有統計學意義(FBeclinl=176.562，PBeclinl=0.000;FBcl-2=470.809，PBcl-2=0.000);兩者聯合作用組Beclinl蛋白表達較單獨處理組升高(P＜0.05)，Bcl-2蛋白表達較單獨處理組降低(P＜0.05)。10μmol/LApoG2，0.25μmol/L紫杉醇及兩者聯合作用于MCF-7細胞48h后，不同處理組Beclinl，Bcl-2蛋白表達差異具

19、有統計學意義(FBeclinl＝57.266，pBeclinl=0.000; FBcl-2=138.495，PBcl-2=0.000);兩者聯合作用組Beclinl蛋白表達較單獨處理組升高(P＜0.05)，Bcl-2蛋白表達較單獨處理組降低(P＜0.05)。
　　 實驗結論:
　　 ApoG2能夠增加人乳腺癌細胞系MCF-7對放射的敏感性，還可以提高紫杉醇對MCF-7細胞殺傷效應。其機制可能與ApoG2誘導癌細胞凋亡和自