豬LMNA基因?qū)τ诩∪夂椭景l(fā)育及分化的調(diào)控研究.pdf

1、豬肉一直是我國最主要的肉類消費(fèi)品，隨著人們生活水平的提高，瘦肉型豬已不能滿足人們對(duì)于豬肉口感的要求了，因此近年來研究人員將科研重點(diǎn)轉(zhuǎn)向了提高豬肉品質(zhì)和口感。通過對(duì)具有優(yōu)良性狀的種豬進(jìn)行主效基因、QTL、SNP、MAS的研究，篩選出影響肌肉或脂肪發(fā)育的相關(guān)基因。研究表明，LMNA基因能夠影響肌肉和脂肪的發(fā)育及生成。LMNA即核纖層蛋白，是結(jié)合于內(nèi)層核膜上參與核膜的形成，并維持細(xì)胞核的形態(tài)，能夠調(diào)控進(jìn)出核孔的通道，影響相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞信號(hào)

2、通路的激活與作用。在人類中LMNA基因突變會(huì)導(dǎo)致肌肉和脂肪發(fā)育，修復(fù)和生成相關(guān)的遺傳?。↙aminopathies），在小鼠中LMNA突變和敲除也會(huì)引起相似的肌肉或脂肪發(fā)育障礙。因此本研究以LMNA基因作為研究對(duì)象，構(gòu)建pcDNA3.1-sLMNA超表達(dá)載體和合成LMNA的干擾siRNA序列，分別對(duì)C2C12和3T3-L1細(xì)胞進(jìn)行超表達(dá)，干擾及分化的實(shí)驗(yàn)，以研究LMNA基因?qū)τ诩∪夂椭镜陌l(fā)育及生成的影響，為以后實(shí)際生產(chǎn)中的豬育種打下一

3、定的基礎(chǔ)。取得的主要研究成果如下:
　　1、根據(jù)基因重組原理，利用豬的cDNA為模版，將LMNA基因連接到pMD18-T載體上，再以重組pMD18-T-sLMNA載體為模版，以內(nèi)切酶NheⅠ和KpnⅠ酶切目的片段和pcDNA3.1載體，構(gòu)建重組超表達(dá)載體pcDNA3.1-sLMNA。分別對(duì)載體進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，PCR和酶切驗(yàn)證。分別將超表達(dá)載體轉(zhuǎn)染C2C12和3T3-L1細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。
　　2、利用構(gòu)建的pcDNA3.

4、1-sLMNA超表達(dá)載體和蘇州吉瑪公司合成的LMNA基因siRNA干擾序列分別轉(zhuǎn)染C2C12成肌細(xì)胞，另外在超表達(dá)和干擾轉(zhuǎn)染同時(shí)分別做C2C12細(xì)胞的0、2、4、6天分化，收集細(xì)胞提取RNA和蛋白做定量PCR和WesternBlot實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示LMNA超表達(dá)會(huì)引起肌肉相關(guān)基因的下調(diào)，LMNA干擾會(huì)引起肌肉相關(guān)基因的上調(diào)，C2C12分化過程中干擾LMNA表達(dá)會(huì)抑制細(xì)胞分化。
　　3、利用超表達(dá)載體pcDNA3.1-sLMNA和LM

5、NA siRNA干擾序列分別轉(zhuǎn)染3T3-L1細(xì)胞，之后超表達(dá)和干擾轉(zhuǎn)染后同時(shí)分別作3T3-L1細(xì)胞的0、2、4、6天分化，收集細(xì)胞提RNA和蛋白做定量PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示超表達(dá)LMNA會(huì)導(dǎo)致脂肪相關(guān)基因表達(dá)下降，干擾LMNA會(huì)導(dǎo)致脂肪相關(guān)基因表達(dá)上升，干擾LMNA基因會(huì)抑制3T3-L1前體脂肪細(xì)胞的分化。
　　4、在C2C12細(xì)胞和3T3-L1細(xì)胞的超表達(dá)LMNA分化實(shí)驗(yàn)中，肌肉和脂肪分化相關(guān)基因在分化第