冬眠與心衰心肌細胞功能重塑的結(jié)構(gòu)與分子調(diào)控機制.pdf

1、冬眠是某些動物為適應冬季寒冷缺食的惡劣環(huán)境而進化產(chǎn)生的一種重要的動物學現(xiàn)象。其中,冬眠哺乳動物的心血管系統(tǒng)適應冬眠和激醒過程的特殊生理條件形成顯著的機能穩(wěn)定性。除了具有耐低溫、抗心律失常、耐缺氧等特點外,冬眠動物心臟的收縮功能在冬眠狀態(tài)下顯著增強,進而提高心臟的泵血能力,使得血液供應在冬眠狀態(tài)心率慢、血液黏度高等不利情況下也能滿足機體正常的生理需求,這正好與心力衰竭疾病心臟收縮力不足的情況相反。因此,全面闡明冬眠狀態(tài)心臟收縮力增強的內(nèi)在

2、機制,將為心力衰竭的治療提供新的醫(yī)學思路。
　　心臟的收縮功能主要由心肌細胞的興奮收縮耦聯(lián)過程介導的,即在動作電位的驅(qū)動下,細胞膜上的電壓門控L型鈣通道(L-type Ca2+channel, LCC)開放,以鈣致鈣釋放的方式觸發(fā)肌質(zhì)網(wǎng)上的鈣釋放通道 Ryanodine受體(Ryanodine receptor, RyR)產(chǎn)生鈣瞬變,進而引起細胞收縮的過程。為了闡明心肌細胞興奮收縮耦聯(lián)過程在冬眠狀態(tài)中的變化,我們采用全細胞膜片鉗結(jié)

3、合激光共激焦鈣成像技術(shù)同步記錄冬眠動物達烏爾黃鼠心肌細胞的L型鈣電流和全細胞鈣瞬變,以測量興奮收縮耦聯(lián)的效率。我們發(fā)現(xiàn),冬眠狀態(tài)下 L型鈣電流密度顯著下降,但其觸發(fā)的鈣瞬變幅度并沒有發(fā)生變化,表明心肌細胞的興奮收縮耦聯(lián)效率顯著提高;而且,冬眠狀態(tài)下肌絲對Ca2+的敏感性增加,從而增強心肌細胞的收縮力。心肌細胞中單個LCC介導的鈣內(nèi)流觸發(fā)RyR開放產(chǎn)生的鈣火花是全細胞鈣瞬變的基本單元。為了探索冬眠狀態(tài)興奮收縮耦聯(lián)效率提高的內(nèi)在機制,我們利

4、用獨特的松鉗技術(shù)結(jié)合鈣成像方法觀測單個LCC與RyR的分子耦聯(lián)過程,通過測量LCC觸發(fā)RyR開放的延遲時間及其成功率來反映LCC與RyR分子間的耦聯(lián)效率。我們發(fā)現(xiàn),LCC觸發(fā)RyR開放的延遲時間在冬眠狀態(tài)中顯著縮短,進而提高LCC觸發(fā)RyR開放的成功率,這表明LCC與RyR分子間的耦聯(lián)效率在冬眠狀態(tài)下顯著增強。另外,鈣火花的幅度顯著上升,表明冬眠狀態(tài)下動員了 RyR簇中更多的通道參與鈣釋放活動。進一步的鈣尖刺記錄實驗表明,冬眠狀態(tài)LCC

5、與 RyR分子間耦聯(lián)效率的提高促使鈣致鈣釋放過程趨向同步化,進而增強全細胞興奮收縮耦聯(lián)的效率。以上結(jié)果證明,LCC與RyR分子間耦聯(lián)效率的提高是冬眠狀態(tài)心臟收縮力增強的內(nèi)在機制。
　　為了進一步探索LCC與RyR分子間耦聯(lián)效率提高的結(jié)構(gòu)與分子機制,我們采用電子顯微鏡技術(shù)檢測心肌細胞橫管與肌質(zhì)網(wǎng)耦聯(lián)結(jié)構(gòu)的變化。我們發(fā)現(xiàn),冬眠狀態(tài)下橫管與肌質(zhì)網(wǎng)耦聯(lián)結(jié)構(gòu)的數(shù)目顯著增多、耦聯(lián)長度顯著增加,使得心肌細胞鈣釋放位點的數(shù)目增多、面積增大。更重要

6、的是,橫管與肌質(zhì)網(wǎng)間的耦聯(lián)距離顯著縮短,使LCC與RyR之間的距離縮短了約40％,從而加快RyR對LCC的響應速度。通過對耦聯(lián)結(jié)構(gòu)相關蛋白表達量的篩查發(fā)現(xiàn),橫管與肌質(zhì)網(wǎng)耦聯(lián)結(jié)構(gòu)維持的關鍵蛋白Junctophilin2(JP2)及其膜相互作用蛋白Caveolin3表達量在冬眠狀態(tài)中顯著上調(diào),這是引起橫管與肌質(zhì)網(wǎng)耦聯(lián)結(jié)構(gòu)重塑的主要原因。這些冬眠過程中心肌細胞功能重塑的結(jié)構(gòu)與分子機制與心力衰竭過程正好相反。基于以上的發(fā)現(xiàn),我們首次提出冬眠是“

7、反心衰”的天然模型。
　　越來越多的研究表明,JP2在維持橫管與肌質(zhì)網(wǎng)耦聯(lián)結(jié)構(gòu)和興奮收縮耦聯(lián)功能中起關鍵作用。那么,探索JP2在心肌細胞中的上游表達調(diào)控機制就顯得尤其重要。為了解決這個問題,我們首先利用生物信息學方法來預測JP2 mRNA3'非編碼區(qū)(untranslated region, UTR)上潛在的miRNA調(diào)控位點。我們發(fā)現(xiàn),進化上非常保守的miR-24在人、大鼠、小鼠等物種的JP2 mRNA3'UTR上都存在著兩個潛

8、在的結(jié)合位點。對其表達量進行分析后發(fā)現(xiàn),miR-24在冬眠過程中下調(diào)了40%,而在心力衰竭病人中上調(diào)了約200%,與JP2表達量的變化正好相反。進一步的熒光素酶報告實驗證實miR-24可以結(jié)合到JP2 mRNA3'UTR上并參與對JP2的表達調(diào)控。為了探索 miR-24對心肌細胞結(jié)構(gòu)和功能的影響,我們采用腺病毒表達系統(tǒng)在培養(yǎng)的成年大鼠心肌細胞中過表達miR-24。結(jié)果顯示,當miR-24表達上調(diào)約150%時,內(nèi)源 JP2 mRNA和蛋白

9、水平的表達量分別下調(diào)了58%和46%。通過結(jié)構(gòu)和功能的檢測發(fā)現(xiàn),過表達 miR-24后橫管與肌質(zhì)網(wǎng)耦聯(lián)結(jié)構(gòu)的數(shù)目顯著減少、耦聯(lián)的長度顯著縮短,進而引起心肌細胞鈣致鈣釋放過程出現(xiàn)不均一性和去同步化,最終削弱心肌細胞的興奮收縮耦聯(lián)功能。過表達miR-24后心肌細胞結(jié)構(gòu)和功能的重塑過程重復了心力衰竭和直接敲減JP2類似的結(jié)果。以上結(jié)果強烈提示我們,在心力衰竭病理情況下miR-24的上調(diào)主要是通過下調(diào)JP2的表達來實現(xiàn)對心臟結(jié)構(gòu)和功能的負調(diào)控,

10、揭示心力衰竭病理過程的關鍵調(diào)控機制。
　　為了進一步探索在心力衰竭發(fā)展過程中抑制 miR-24的上調(diào)是否可以阻止JP2表達的下調(diào),進而阻止心力衰竭的發(fā)生。我們采用主動脈結(jié)扎的小鼠模型,通過尾靜脈注射特異針對miR-24的antagomir來干擾miR-24表達的上調(diào),并通過超聲心動定期檢測心臟整體功能的變化。我們發(fā)現(xiàn),antagomir能夠有效地抑制主動脈結(jié)扎小鼠心肌細胞miR-24表達的上調(diào)和JP2表達的下調(diào),從而阻止心臟整體收

11、縮功能的下降。在單細胞水平上表現(xiàn)為,antagomir可以有效地維持心肌細胞橫管與肌質(zhì)網(wǎng)的耦聯(lián)結(jié)構(gòu)以及興奮收縮耦聯(lián)的功能。以上結(jié)果表明,在體抑制miR-24表達的上調(diào)能夠有效地阻止主動脈結(jié)扎小鼠心臟功能向去代償階段的轉(zhuǎn)變。這樣,miR-24就可以為心力衰竭的治療提供一個潛在的藥物靶點。
　　綜上所述,本文的研究第一次全面闡明冬眠動物心臟的收縮力在冬眠狀態(tài)中增強的結(jié)構(gòu)與分子機制,證明冬眠狀態(tài)中JP2和Caveolin3蛋白表達的上調(diào)