冬眠與心衰心肌細(xì)胞功能重塑的結(jié)構(gòu)與分子調(diào)控機(jī)制.pdf

1、冬眠是某些動(dòng)物為適應(yīng)冬季寒冷缺食的惡劣環(huán)境而進(jìn)化產(chǎn)生的一種重要的動(dòng)物學(xué)現(xiàn)象。其中,冬眠哺乳動(dòng)物的心血管系統(tǒng)適應(yīng)冬眠和激醒過(guò)程的特殊生理?xiàng)l件形成顯著的機(jī)能穩(wěn)定性。除了具有耐低溫、抗心律失常、耐缺氧等特點(diǎn)外,冬眠動(dòng)物心臟的收縮功能在冬眠狀態(tài)下顯著增強(qiáng),進(jìn)而提高心臟的泵血能力,使得血液供應(yīng)在冬眠狀態(tài)心率慢、血液黏度高等不利情況下也能滿足機(jī)體正常的生理需求,這正好與心力衰竭疾病心臟收縮力不足的情況相反。因此,全面闡明冬眠狀態(tài)心臟收縮力增強(qiáng)的內(nèi)在

2、機(jī)制,將為心力衰竭的治療提供新的醫(yī)學(xué)思路。
　　心臟的收縮功能主要由心肌細(xì)胞的興奮收縮耦聯(lián)過(guò)程介導(dǎo)的,即在動(dòng)作電位的驅(qū)動(dòng)下,細(xì)胞膜上的電壓門控L型鈣通道(L-type Ca2+channel, LCC)開(kāi)放,以鈣致鈣釋放的方式觸發(fā)肌質(zhì)網(wǎng)上的鈣釋放通道 Ryanodine受體(Ryanodine receptor, RyR)產(chǎn)生鈣瞬變,進(jìn)而引起細(xì)胞收縮的過(guò)程。為了闡明心肌細(xì)胞興奮收縮耦聯(lián)過(guò)程在冬眠狀態(tài)中的變化,我們采用全細(xì)胞膜片鉗結(jié)

3、合激光共激焦鈣成像技術(shù)同步記錄冬眠動(dòng)物達(dá)烏爾黃鼠心肌細(xì)胞的L型鈣電流和全細(xì)胞鈣瞬變,以測(cè)量興奮收縮耦聯(lián)的效率。我們發(fā)現(xiàn),冬眠狀態(tài)下 L型鈣電流密度顯著下降,但其觸發(fā)的鈣瞬變幅度并沒(méi)有發(fā)生變化,表明心肌細(xì)胞的興奮收縮耦聯(lián)效率顯著提高;而且,冬眠狀態(tài)下肌絲對(duì)Ca2+的敏感性增加,從而增強(qiáng)心肌細(xì)胞的收縮力。心肌細(xì)胞中單個(gè)LCC介導(dǎo)的鈣內(nèi)流觸發(fā)RyR開(kāi)放產(chǎn)生的鈣火花是全細(xì)胞鈣瞬變的基本單元。為了探索冬眠狀態(tài)興奮收縮耦聯(lián)效率提高的內(nèi)在機(jī)制,我們利

4、用獨(dú)特的松鉗技術(shù)結(jié)合鈣成像方法觀測(cè)單個(gè)LCC與RyR的分子耦聯(lián)過(guò)程,通過(guò)測(cè)量LCC觸發(fā)RyR開(kāi)放的延遲時(shí)間及其成功率來(lái)反映LCC與RyR分子間的耦聯(lián)效率。我們發(fā)現(xiàn),LCC觸發(fā)RyR開(kāi)放的延遲時(shí)間在冬眠狀態(tài)中顯著縮短,進(jìn)而提高LCC觸發(fā)RyR開(kāi)放的成功率,這表明LCC與RyR分子間的耦聯(lián)效率在冬眠狀態(tài)下顯著增強(qiáng)。另外,鈣火花的幅度顯著上升,表明冬眠狀態(tài)下動(dòng)員了 RyR簇中更多的通道參與鈣釋放活動(dòng)。進(jìn)一步的鈣尖刺記錄實(shí)驗(yàn)表明,冬眠狀態(tài)LCC

5、與 RyR分子間耦聯(lián)效率的提高促使鈣致鈣釋放過(guò)程趨向同步化,進(jìn)而增強(qiáng)全細(xì)胞興奮收縮耦聯(lián)的效率。以上結(jié)果證明,LCC與RyR分子間耦聯(lián)效率的提高是冬眠狀態(tài)心臟收縮力增強(qiáng)的內(nèi)在機(jī)制。
　　為了進(jìn)一步探索LCC與RyR分子間耦聯(lián)效率提高的結(jié)構(gòu)與分子機(jī)制,我們采用電子顯微鏡技術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞橫管與肌質(zhì)網(wǎng)耦聯(lián)結(jié)構(gòu)的變化。我們發(fā)現(xiàn),冬眠狀態(tài)下橫管與肌質(zhì)網(wǎng)耦聯(lián)結(jié)構(gòu)的數(shù)目顯著增多、耦聯(lián)長(zhǎng)度顯著增加,使得心肌細(xì)胞鈣釋放位點(diǎn)的數(shù)目增多、面積增大。更重要

6、的是,橫管與肌質(zhì)網(wǎng)間的耦聯(lián)距離顯著縮短,使LCC與RyR之間的距離縮短了約40％,從而加快RyR對(duì)LCC的響應(yīng)速度。通過(guò)對(duì)耦聯(lián)結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白表達(dá)量的篩查發(fā)現(xiàn),橫管與肌質(zhì)網(wǎng)耦聯(lián)結(jié)構(gòu)維持的關(guān)鍵蛋白Junctophilin2(JP2)及其膜相互作用蛋白Caveolin3表達(dá)量在冬眠狀態(tài)中顯著上調(diào),這是引起橫管與肌質(zhì)網(wǎng)耦聯(lián)結(jié)構(gòu)重塑的主要原因。這些冬眠過(guò)程中心肌細(xì)胞功能重塑的結(jié)構(gòu)與分子機(jī)制與心力衰竭過(guò)程正好相反。基于以上的發(fā)現(xiàn),我們首次提出冬眠是“

7、反心衰”的天然模型。
　　越來(lái)越多的研究表明,JP2在維持橫管與肌質(zhì)網(wǎng)耦聯(lián)結(jié)構(gòu)和興奮收縮耦聯(lián)功能中起關(guān)鍵作用。那么,探索JP2在心肌細(xì)胞中的上游表達(dá)調(diào)控機(jī)制就顯得尤其重要。為了解決這個(gè)問(wèn)題,我們首先利用生物信息學(xué)方法來(lái)預(yù)測(cè)JP2 mRNA3'非編碼區(qū)(untranslated region, UTR)上潛在的miRNA調(diào)控位點(diǎn)。我們發(fā)現(xiàn),進(jìn)化上非常保守的miR-24在人、大鼠、小鼠等物種的JP2 mRNA3'UTR上都存在著兩個(gè)潛

8、在的結(jié)合位點(diǎn)。對(duì)其表達(dá)量進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn),miR-24在冬眠過(guò)程中下調(diào)了40%,而在心力衰竭病人中上調(diào)了約200%,與JP2表達(dá)量的變化正好相反。進(jìn)一步的熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-24可以結(jié)合到JP2 mRNA3'UTR上并參與對(duì)JP2的表達(dá)調(diào)控。為了探索 miR-24對(duì)心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的影響,我們采用腺病毒表達(dá)系統(tǒng)在培養(yǎng)的成年大鼠心肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-24。結(jié)果顯示,當(dāng)miR-24表達(dá)上調(diào)約150%時(shí),內(nèi)源 JP2 mRNA和蛋白

9、水平的表達(dá)量分別下調(diào)了58%和46%。通過(guò)結(jié)構(gòu)和功能的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá) miR-24后橫管與肌質(zhì)網(wǎng)耦聯(lián)結(jié)構(gòu)的數(shù)目顯著減少、耦聯(lián)的長(zhǎng)度顯著縮短,進(jìn)而引起心肌細(xì)胞鈣致鈣釋放過(guò)程出現(xiàn)不均一性和去同步化,最終削弱心肌細(xì)胞的興奮收縮耦聯(lián)功能。過(guò)表達(dá)miR-24后心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的重塑過(guò)程重復(fù)了心力衰竭和直接敲減JP2類似的結(jié)果。以上結(jié)果強(qiáng)烈提示我們,在心力衰竭病理情況下miR-24的上調(diào)主要是通過(guò)下調(diào)JP2的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)心臟結(jié)構(gòu)和功能的負(fù)調(diào)控,

10、揭示心力衰竭病理過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制。
　　為了進(jìn)一步探索在心力衰竭發(fā)展過(guò)程中抑制 miR-24的上調(diào)是否可以阻止JP2表達(dá)的下調(diào),進(jìn)而阻止心力衰竭的發(fā)生。我們采用主動(dòng)脈結(jié)扎的小鼠模型,通過(guò)尾靜脈注射特異針對(duì)miR-24的antagomir來(lái)干擾miR-24表達(dá)的上調(diào),并通過(guò)超聲心動(dòng)定期檢測(cè)心臟整體功能的變化。我們發(fā)現(xiàn),antagomir能夠有效地抑制主動(dòng)脈結(jié)扎小鼠心肌細(xì)胞miR-24表達(dá)的上調(diào)和JP2表達(dá)的下調(diào),從而阻止心臟整體收

11、縮功能的下降。在單細(xì)胞水平上表現(xiàn)為,antagomir可以有效地維持心肌細(xì)胞橫管與肌質(zhì)網(wǎng)的耦聯(lián)結(jié)構(gòu)以及興奮收縮耦聯(lián)的功能。以上結(jié)果表明,在體抑制miR-24表達(dá)的上調(diào)能夠有效地阻止主動(dòng)脈結(jié)扎小鼠心臟功能向去代償階段的轉(zhuǎn)變。這樣,miR-24就可以為心力衰竭的治療提供一個(gè)潛在的藥物靶點(diǎn)。
　　綜上所述,本文的研究第一次全面闡明冬眠動(dòng)物心臟的收縮力在冬眠狀態(tài)中增強(qiáng)的結(jié)構(gòu)與分子機(jī)制,證明冬眠狀態(tài)中JP2和Caveolin3蛋白表達(dá)的上調(diào)