MGr1-Ag-37LRP參與PrPC介導的胃癌細胞多藥耐藥.pdf

1、胃癌嚴重威脅著國人的生命健康?；暖熓钱斍巴砥谖赴┑闹匾委熓侄危[瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥致使胃癌治療失效是胃癌致死的重要因素。因此，多藥耐藥作為胃癌惡性生物學行為發(fā)展演進和治療過程中的重要環(huán)節(jié)，是胃癌干預和治療研究的關(guān)鍵所在，也是本實驗室多年來致力研究的重要方向之一。
　　MGr1是本實驗室前期研究篩選得到的一株具有自主知識產(chǎn)權(quán)的與胃癌耐藥密切相關(guān)的單克隆抗體，其抗原在胃癌耐藥細胞系SGC7901/VCR中的表達水平顯著高

2、于其親本細胞系 SGC7901，后續(xù)研究鑒定出 MGr1識別的目標分子為37LRP。MGr1-Ag/37LRP可能參與了缺氧等多個胃癌耐藥相關(guān)信號轉(zhuǎn)導通路，通過調(diào)節(jié)P-gp、MRP、Bcl-2、Bax和FAK、PI3K等分子參與胃癌MDR。PrPC是本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)的與胃癌多藥耐藥密切相關(guān)分子群的重要成員。研究發(fā)現(xiàn)PrPC在胃癌細胞系和組織中廣泛表達，并在胃癌耐藥細胞系中較親本細胞系表達顯著升高。PrPC可能同時參與了胃癌細胞系SG

3、C7901中P-gp依賴和P-gp非依賴的耐藥，經(jīng)典MDR分子P-gp、凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bax以及PI3K/Akt是PrPC參與胃癌MDR的可能分子通路。PrPC同時被研究證實還參與了增殖、轉(zhuǎn)移等多個胃癌惡性生物學表型。
　　然而，PrPC作為一個 GPI錨定分子，是如何將細胞外信號傳遞至細胞內(nèi)從而引起胃癌細胞的一系列生物學效應的呢？國外同期研究報道37LRP通過介導病理型朊蛋白（PrPSc）在人腸上皮細胞的內(nèi)吞促進瘋牛病

4、的感染。這兩個蛋白又被我們發(fā)現(xiàn)同時在缺氧誘導的胃癌MDR中發(fā)揮作用，并經(jīng)由相似的分子信號通路影響了胃癌的MDR表型。這引起了我們的極大興趣，是否MGr1-Ag/37LRP參與了PrPC相關(guān)的胃癌MDR，他們在胃癌耐藥中又有著怎樣的聯(lián)系？
　　研究目的：
　　1.對MGr1雜交瘤細胞進行克隆化和鑒定并對MGr1小鼠腹水進行純化和鑒定，檢測MGr1對胃癌耐藥細胞藥物敏感性和細胞增殖的影響；2.研究MGr1-Ag/37LRP和Pr

5、PC在胃癌中的表達相關(guān)性、蛋白表達共定位及相互作用；3.研究胃癌細胞中PrPC對MGr1-Ag/37LRP是否具有調(diào)控作用及 MGr1-Ag/37LRP是否參與PrPC介導的胃癌MDR；4.如果MGr1-Ag/37LRP參與了PrPC介導的胃癌MDR，初步探討其可能的機制。
　　研究方法：
　　1. MGr1的克隆化、純化鑒定及對胃癌耐藥細胞藥物敏感性和細胞增殖的影響：有限稀釋法對 MGr1雜交瘤細胞進行克隆化，免疫細胞化學

6、檢測 MGr1雜交瘤亞克隆細胞系分泌單抗的能力；將挑選出的 MGr1雜交瘤亞克隆細胞系制備小鼠腹水，Western blot檢測其抗體效價；利用辛酸-硫酸銨沉淀法、xMagTM ProteinG磁珠親和法和rProteinG親和純化法對小鼠腹水進行純化，Western blot檢測其抗體活性及效價；Hoechst染色結(jié)合藥敏實驗，利用ArrayScan? VTI高內(nèi)涵篩選分析儀檢測MGr1純化抗體對胃癌耐藥細胞系 SGC7901/VCR

7、的5-FU藥物敏感性的影響；利用ArrayScan? VTI高內(nèi)涵篩選分析儀結(jié)合Hoechst染色，檢測MGr1純化抗體對胃癌耐藥細胞系SGC7901/VCR細胞增殖的影響。
　　2. MGr1-Ag/37LRP和PrPC在胃癌中的表達相關(guān)性、表達共定位及相互作用：Western blot檢測MGr1-Ag/37LRP和PrPC在胃癌細胞系SGC7901、SGC7901/VCR、MKN28和AGS中的表達水平，分析其表達相關(guān)性；免

8、疫組織化學染色檢測MGr1-Ag/37LRP和PrPC在胃癌患者組織標本中的表達水平及相關(guān)性；免疫細胞熒光染色結(jié)合激光共聚焦檢測MGr1-Ag/37LRP和PrPC在胃癌細胞系SGC7901、AGS及胃癌患者組織標本中中的表達共定位；免疫共沉淀實驗檢測MGr1-Ag/37LRP和PrPC在胃癌細胞系SGC7901/VCR中的相互作用。
　　3. MGr1-Ag/37LRP是否參與PrPC介導的胃癌 MDR：Western blot

9、檢測MGr1-Ag/37LRP在過表達和抑制表達 PrPC的胃癌穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系 SGC7901/PrP和SGC7901/PrPi中的蛋白表達水平；siRNA下調(diào)胃癌耐藥細胞系SGC7901/VCR和過表達PrPC的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胃癌細胞系SGC7901/PrP中MGr1-Ag/37LRP的表達，Western blot檢測MGr1-Ag/37LRP siRNA的干擾效果；MTT法檢測MGr1-Ag/37LRP siRNA和MGr1純化抗體對S

10、GC7901/VCR和SGC7901/PrP細胞系藥物敏感性的影響。
　　4. MGr1-Ag/37LRP參與PrPC介導胃癌MDR的可能機制：ADR蓄積潴留實驗檢測MGr1-Ag/37LRP siRNA對SGC7901/VCR和SGC7901/PrP細胞系A(chǔ)DR泵出率的影響；Hoechst染色觀察MGr1-Ag/37LRP siRNA對SGC7901/PrP細胞系經(jīng)VCR誘導后的細胞凋亡的影響；AnnexinⅤ/PI雙染色結(jié)合流

11、式細胞儀檢測 MGr1-Ag/37LRP siRNA對SGC7901/VCR和SGC7901/PrP細胞系經(jīng)VCR誘導后細胞凋亡率的影響；Caspase3活性染色結(jié)合 ArrayScan? VTI高內(nèi)涵篩選分析儀檢測 MGr1-Ag/37LRP siRNA對SGC7901/PrP細胞系經(jīng)VCR誘導后caspase3活性的影響。Western blot檢測MGr1-Ag/37LRP siRNA對SGC7901/PrP細胞系經(jīng)VCR誘導后A

12、kt/pAkt表達的影響。
　　研究結(jié)果：
　　1. MGr1的克隆化、純化鑒定及對胃癌耐藥細胞藥物敏感性和細胞增殖的影響：經(jīng)過克隆化和免疫細胞化學染色篩選，得到一株能高效分泌 MGr1單克隆抗體的小鼠雜交瘤細胞亞系MGr1-5；用雜交瘤細胞亞系MGr1-5制備的小鼠腹水，Western blot可獲得陽性目的條帶，且抗體效價可達1:2000，xMagTM ProteinG磁珠親和法和rProteinG親和純化法均適用于MG

13、r1小鼠腹水的純化；采用Hoechst染色結(jié)合藥敏實驗，利用ArrayScan? VTI高內(nèi)涵篩選分析儀檢測結(jié)果提示，終濃度為20μg/ml的MGr1純化抗體可顯著增加胃癌耐藥細胞系 SGC7901/VCR對5-FU的敏感性（p＜0.05）；利用ArrayScan? VTI高內(nèi)涵篩選分析儀結(jié)合Hoechst染色檢測結(jié)果提示，終濃度為20μg/ml的MGr1組和2μg/ml的5-FU組均與陰性對照組之間具有統(tǒng)計學差異（p＜0.05），且這

14、兩組之間沒有統(tǒng)計學差異（p＞0.05）；但這兩組與小鼠IgG對照組間沒有顯著差異（p＞0.05），小鼠IgG對照組與陰性對照組之間也沒有顯著差異（p＞0.05），因此尚不能認為MGr1可以直接影響SGC7901/VCR細胞的增殖；
　　2. MGr1-Ag/37LRP和PrPC在胃癌中的表達相關(guān)性、表達共定位及相互作用：Western blot和灰度分析結(jié)果顯示 MGr1-Ag/37LRP和PrPC在胃癌細胞系SGC7901/VC

15、R、SGC7901、AGS和MKN28中表達趨勢一致，并具有顯著相關(guān)性（p＜0.05）；免疫組織化學染色檢測提示，MGr1-Ag/37LRP和PrPC在同一患者的連續(xù)組織切片中呈現(xiàn)一致的表達模式，統(tǒng)計學分析結(jié)果顯示所檢測的50例樣本中，MGr1-Ag/37LRP和PrPC的表達陽性率分別為52％和66%，二者的表達存在顯著相關(guān)性（p<0.05，r=0.3786）；免疫細胞熒光染色結(jié)合激光共聚焦檢測結(jié)果顯示，MGr1-Ag/37LRP和P

16、rPC在胃癌細胞系中主要表達在細胞漿和細胞膜，在AGS和SGC7901中均可見MGr1-Ag/37LRP和PrPC存在部分共定位；免疫組織熒光染色結(jié)合激光共聚焦顯微鏡掃描結(jié)果顯示，MGr1-Ag/37LRP和PrPC在胃癌組織的腺體中存在共定位；免疫共沉淀實驗結(jié)果顯示，利用Protein A/G Agarose結(jié)合PrPC的兔抗人多抗，可將 SGC7901/VCR細胞中的 PrPC及 MGr1-Ag/37LRP共沉淀，提示MGr1-Ag

17、/37LRP及PrPC在胃癌細胞中共同存在于一個蛋白復合體，可能存在相互作用。
　　3. MGr1-Ag/37LRP是否參與PrPC介導的胃癌MDR：Western blot檢測結(jié)果提示，MGr1-Ag/37LRP在過表達PrPC的胃癌穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系SGC7901/PrP中的蛋白表達水平較轉(zhuǎn)入空載體的對照細胞系明顯增高，在抑制 PrPC表達的胃癌穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系SGC7901/PrPi中較轉(zhuǎn)入空載體的對照細胞系明顯降低，提示PrPC

18、蛋白表達水平可能影響或調(diào)控 MGr1-Ag/37LRP蛋白的表達；用 siRNA下調(diào)胃癌細胞系中MGr1-Ag/37LRP的表達，Western blot檢測顯示，轉(zhuǎn)染MGr1-Ag/37LRP siRNA后的SGC7901/PrP和SGC7901/VCR細胞中MGr1-Ag/37LRP的蛋白表達量較轉(zhuǎn)染陰性對照的細胞中顯著減少（p＜0.05），證明該siRNA可以有效地抑制MGr1-Ag/37LRP的蛋白表達；藥敏實驗結(jié)果顯示，MGr

19、1-Ag/37LRP siRNA可以顯著增加SGC7901/PrP和SGC7901/VCR細胞系對P-gp依賴的ADR、VCR和VP-16以及P-gp非依賴的5-FU和CDDP的藥物敏感性（p＜0.05）；MGr1純化抗體也可以顯著增加SGC7901/PrP對上述化療藥物的敏感性（p＜0.05），提示MGr1-Ag/37LRP可能通過P-gp相關(guān)和非相關(guān)的分子機制參與了PrPC介導的胃癌MDR。
　　4. MGr1-Ag/37LR

20、P參與PrPC介導胃癌MDR的可能機制：ADR蓄積潴留實驗結(jié)果顯示，瞬時轉(zhuǎn)染MGr1-Ag/37LRP siRNA的SGC7901/VCR和SGC7901/PrP細胞系較轉(zhuǎn)染 siRNA陰性對照的細胞阿霉素泵出能力顯著下降（p＜0.05），提示MGr1-Ag/37LRP可能通過影響胃癌細胞對化療藥物的攝取和泵出能力參與PrPC介導的胃癌MDR；Hoechst染色檢測結(jié)果顯示，經(jīng)VCR誘導后瞬時轉(zhuǎn)染MGr1-Ag/37LRP siRNA的

21、SGC7901/PrP細胞系較轉(zhuǎn)染siRNA陰性對照的細胞系凋亡細胞明顯增多；AnnexinⅤ/PI雙染色結(jié)合流式細胞術(shù)檢測結(jié)果提示，瞬時轉(zhuǎn)染 MGr1-Ag/37LRP siRNA的 SGC7901/VCR和SGC7901/PrP細胞系較轉(zhuǎn)染 siRNA陰性對照的細胞經(jīng)VCR誘導后細胞凋亡率顯著升高（p＜0.05），提示 MGr1-Ag/37LRP另一方面可能通過影響胃癌細胞對化療藥物誘導的凋亡抵抗參與了PrPC介導的胃癌MDR；Ca

22、spase3活性染色結(jié)合 ArrayScan? VTI高內(nèi)涵篩選分析儀檢測結(jié)果顯示，瞬時轉(zhuǎn)染MGr1-Ag/37LRP siRNA的SGC7901/PrP細胞系較轉(zhuǎn)染siRNA陰性對照的細胞經(jīng)VCR誘導后caspase3活性顯著增加，進一步證實抑制MGr1-Ag/37LRP的表達可以顯著促進化療藥物誘導后 SGC7901/PrP發(fā)生細胞凋亡。Western blot檢測顯示，瞬時轉(zhuǎn)染MGr1-Ag/37LRP siRNA的SGC7901

23、/PrP細胞系較轉(zhuǎn)染siRNA陰性對照的細胞經(jīng)VCR誘導后pAkt的表達水平顯著降低，提示MGr1-Ag/37LRP可能通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路影響了PrPC介導的胃癌MDR。
　　結(jié)論：
　　MGr1-5是一株可以有效分泌MGr1的小鼠雜交瘤細胞亞系，xMagTM ProteinG磁珠親和法和rProtein G親和純化法均適用于 MGr1小鼠腹水的純化。終濃度為20μg/ml的MGr1純化抗體可顯著增加胃癌耐藥細胞系

24、SGC7901/VCR對5-FU的敏感性，尚不能認為MGr1可以直接影響SGC7901/VCR細胞的增殖。MGr1-Ag/37LRP與PrPC在胃癌細胞系和組織中具有良好的表達相關(guān)性和表達共定位，可能存在相互作用關(guān)系。MGr1-Ag/37LRP的蛋白表達水平受PrPC蛋白表達的調(diào)控，且參與了PrPC介導的胃癌MDR。MGr1-Ag/37LRP siRNA和MGr1純化抗體（20μg/ml）可部分逆轉(zhuǎn)PrPC介導的胃癌MDR表型。MGr1

25、-Ag/37LRP可能同時參與了PrPC介導的胃癌細胞化療藥物泵出能力的提高和對化療藥物誘導的細胞凋亡的抵抗。其分子機制可能是MGr1-Ag/37LRP通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路參與了PrPC介導的胃癌MDR。結(jié)合本實驗室的前期研究結(jié)果，MGr1-Ag/37LRP可能是PrPC介導的胃癌MDR相關(guān)信號通路的重要調(diào)節(jié)分子，仍需要更多的分子機制研究和體內(nèi)研究結(jié)果來證實我們的發(fā)現(xiàn)。本研究充實了MGr1-Ag/37LRP作為新的胃癌多藥耐藥干