RNASET2分子在白癜風(fēng)發(fā)病中的作用及機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進行了論述：
　　第一部分 應(yīng)激對人表皮角質(zhì)形成細胞和黑素細胞RNASET2的表達影響
　　目的:探討白癜風(fēng)患者皮損區(qū)RNASET2的表達情況;運用改良方法，簡單、經(jīng)濟地從人包皮組織中分離擴增得到大量高純度原代角質(zhì)形成細胞(HEKs)和黑素細胞(HEMs);在體外觀察應(yīng)激因素作用下HEKs和HEMs中RNASET2的表達情況。
　　方法:利用實時PCR和Western blot分析了白癜風(fēng)皮損處RN

2、ASET2的表達，并用RNASET2的多克隆抗體進行免疫組化研究，以確定白癜風(fēng)樣品中RNASET2表達情況;根據(jù)原代角質(zhì)形成細胞和黑素細胞對胰酶的不同耐受性和成纖維細胞不能耐受G418的特性可分離出純原代黑素細胞和角質(zhì)細胞;過量的紫外線照射(NB-UVB)、氧化應(yīng)激(H2O2)、炎癥(LPS)刺激體外培養(yǎng)的HEKs和HEMs，利用實時PCR，Western blot和免疫熒光檢測技術(shù)鑒定HEKs和HEMs在應(yīng)激作用下RNASET2表達情

3、況。
　　結(jié)果:與正常對照組相比較，白癜風(fēng)患者皮損RNASET2在轉(zhuǎn)錄（白癜風(fēng)vs對照組:4.056±1.115 vs1.034±0.166; p＜0.001）和蛋白水平都顯著升高;成功從人包皮組織中分離擴增得到大量高純度HEKs和HEMs;與未處理組比較，HEKs和HEMs在一定應(yīng)激作用劑量范圍內(nèi)，RNASET2在轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平都有明顯升高。
　　結(jié)論:白癜風(fēng)患者皮損處RNASET2顯著增加;白癜風(fēng)誘發(fā)因素可以使HEK

4、s和HEMs中RNASET2表達增加。
　　第二部分 RNASET2基因產(chǎn)物對原代角質(zhì)形成細胞和黑素細胞生物學(xué)功能的影響
　　目的:探討體外RNASET2過表達對原代培養(yǎng)的角質(zhì)形成細胞和黑素細胞的生物學(xué)功能影響。
　　方法:利用RNASET2過表達慢病毒分別感染原代角質(zhì)形成細胞和黑素細胞;感染后72h，用熒光顯微鏡觀察鑒定了慢病毒感染細胞的效率;通過Western blot技術(shù)對感染結(jié)果進行了鑒定;采用CCK-8細胞活

5、性實驗、Annexin V-APC/7-AAD雙色標(biāo)記法和colony-forming法對RNASET2過表達原代角質(zhì)形成細胞和黑素細胞的增殖凋亡情況進行了研究;通過將適當(dāng)濃度的外源性氧化應(yīng)激因素H2O2加入RNASET2過表達的原代角質(zhì)形成細胞和黑素細胞中，觀察氧化應(yīng)激對RNASET2過表達細胞的影響;采用實時PCR、Western blot、黑素含量測定以及酪氨酸酶活性測定等技術(shù)檢測RNASET2過表達對黑素細胞合成黑素能力的影響情

6、況。
　　結(jié)果:慢病毒成功感染原代角質(zhì)形成細胞和黑素細胞72h后，感染效率＞90％;與轉(zhuǎn)染空載體(VECTOR)細胞比較，RNASET2過表達(OE RNASET2)引起原代角質(zhì)形成細胞(VECTOR vs OE RNASET2:4.167±0.330 vs23.467±1.482;p=0.003)和黑素細胞(VECTOR vs OE RNASET2:5.400±0.455 vs27.333±1.053;p=0.001)的凋亡具有

7、統(tǒng)計學(xué)意義;RNASET2過表達使原代角質(zhì)形成細胞和黑素細胞對氧化應(yīng)激更敏感;RNASET2過表達導(dǎo)致黑素細胞合成黑素能力下降。
　　結(jié)論:RNASET2過表達導(dǎo)致原代角質(zhì)形成細胞和黑素細胞凋亡;RNASET2過表達導(dǎo)致黑素細胞合成黑素能力下降。
　　第三部分 RNASET2基因產(chǎn)物在白癜風(fēng)發(fā)病中的機制研究
　　目的:探討RNASET2過表達導(dǎo)致原代角質(zhì)形成細胞和黑素細胞凋亡和黑素合成下降引發(fā)白癜風(fēng)的機制。
　　

8、方法:為探討RNASET2的促凋亡作用是否依賴于其催化位點，采用RNASET2催化位點突變后的過表達慢病毒(OE RNASET2-ci)分別轉(zhuǎn)染原代角質(zhì)形成細胞和黑素細胞;同時，由于最近研究發(fā)現(xiàn)RNASET2的結(jié)構(gòu)中含有能結(jié)合凋亡因子TRAF2的結(jié)構(gòu)域，為證實RNASET2分子中TRAF2結(jié)構(gòu)域是否與RNASET2的促凋亡作用相關(guān)，我們將RNASET2的TRAF2結(jié)合位點突變后的過表達慢病毒(OE RNASET2-ti)分別轉(zhuǎn)染原代角質(zhì)

9、形成細胞和黑素細胞;用熒光顯微鏡觀察鑒定了慢病毒感染細胞的效率;通過Western blot技術(shù)對感染結(jié)果進行了鑒定;采用CCK-8細胞活性實驗和Annexin V-APC/7-AAD雙色標(biāo)記法對RNASET2過表達原代角質(zhì)形成細胞和黑素細胞的增殖凋亡情況進行了研究;為探討RNASET2的促凋亡作用依賴于RNASET2蛋白與TRAF2蛋白的相互結(jié)合作用，采用免疫共沉淀(CO-IP)及Western blot技術(shù)檢測RNASET2突變前后

10、過表達對細胞凋亡的影響情況。
　　結(jié)果:RNASET2催化位點突變后的過表達慢病毒(OE RNASET2-ci)和RNASET2的TRAF2結(jié)合位點突變后的過表達慢病毒(OE RNASET2-ti)分別成功感染原代角質(zhì)形成細胞和黑素細胞，感染效率＞90％; RNASET2基因產(chǎn)物導(dǎo)致細胞凋亡不依賴于其催化位點，而是與凋亡因子TRAF2密切相關(guān);RNASET2通過RNASET2-TRAF2-caspases通路引起細胞凋亡。