中國(guó)荷斯坦奶牛SRY基因HMG盒原核表達(dá)載體構(gòu)建及表達(dá).pdf

1、奶牛是經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的動(dòng)物，實(shí)現(xiàn)對(duì)奶牛的性別控制，可以在相當(dāng)大的程度上節(jié)約生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。中國(guó)荷斯坦奶牛是我國(guó)的培育品種，將其作為研究對(duì)象更具有現(xiàn)實(shí)意義，并且對(duì)其性別決定機(jī)制的深入研究不僅有助于人們對(duì)奶牛性別控制的理論和實(shí)踐的認(rèn)識(shí)，而且很有可能提出奶牛性別鑒定新的方法。 性別控制是一項(xiàng)能顯著提高畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的生物工程技術(shù)，對(duì)家畜育種、繁殖、生產(chǎn)和遺傳疾病的防治均有非常重要的意義。一個(gè)世紀(jì)以來(lái)，性別形成機(jī)理的研究已由形態(tài)學(xué)

2、水平發(fā)展到分子水平，哺乳動(dòng)物的性別決定依賴(lài)于Y染色體上的SRY基因(sex-determiIung region of Y gene)，它使原始性腺發(fā)育成為睪丸。眾多研究表明：SRY基因突變引起人或其它哺乳動(dòng)物性腺發(fā)育受阻。另外，通過(guò)對(duì)一些性反轉(zhuǎn)病例的研究發(fā)現(xiàn)，性別決定是一個(gè)多基因級(jí)聯(lián)調(diào)控的過(guò)程。性別控制的方法也隨性別決定理論研究的深入得到同步發(fā)展，從個(gè)體水平、細(xì)胞水平發(fā)展到分子水平，為性別控制研究提供了理論依據(jù)和先進(jìn)技術(shù)手段。

3、 SRY基因位于Y染色體上靠近擬常染色質(zhì)區(qū)一個(gè)35 kb的區(qū)域，在進(jìn)化上高度保守，該基因所編碼蛋白中有一段含有70個(gè)氨基酸殘基的序列具有DNA結(jié)合蛋白的特征，被命名為HMG box(High Mobility Group，HMG)。HMG box是SRY蛋白的保守區(qū)，由約80個(gè)氨基酸組成，存在于許多DNA結(jié)合蛋白中。幾乎所有的哺乳動(dòng)物中，均含有SRY蛋白，而其中均含有一個(gè)HMG box。到目前為止，引起性反轉(zhuǎn)的所有SRY基因突變位點(diǎn)幾

4、乎全位于HMG box序列內(nèi)。這說(shuō)明SRY基因是性別決定的核心基因，直接誘導(dǎo)精巢發(fā)育，對(duì)睪丸發(fā)育起著關(guān)鍵性的作用。 本研究是利用基因工程技術(shù)對(duì)SRY基因HMG box的核心序列進(jìn)行克隆和表達(dá)，不僅對(duì)牛SRY基因的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行深入研究，而且能夠在體外對(duì)牛SRY融合蛋白的功能進(jìn)行分析，進(jìn)一步了解SRY基因的作用機(jī)制，為性別決定機(jī)制的闡明奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本研究進(jìn)行了一下幾方面工作： (1)抽取雄性荷斯坦奶牛血液，參考分子克

5、隆技術(shù)從血液中提取RNA，利用一步法RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出SRY基因的cDNA序列，根據(jù)GeneBank收錄的奶牛SRY基因序列，設(shè)計(jì)了一對(duì)使擴(kuò)增產(chǎn)物包括SRY基因編碼區(qū)的引物(因SRY基因?yàn)閱瓮怙@子基因，其編碼區(qū)可直接用以基因組DNA為模板的PCR反應(yīng)獲得)，將擴(kuò)增產(chǎn)物連接至pMD18-T載體，送至生物公司進(jìn)行序列分析。結(jié)果顯示，已經(jīng)獲得了中國(guó)荷斯坦牛SRY基因的編碼區(qū)全長(zhǎng)，基因編碼區(qū)與GeneBank收錄的奶牛SRY基因同源性達(dá)到9

6、9.5％。 (2)根據(jù)牛SRY基因編碼區(qū)和pET-28a(+)載體設(shè)計(jì)一對(duì)分別帶有酶切位點(diǎn)XhoⅠ和EcoRⅠ的引物，以構(gòu)建好的pMD18-T/SRY載體為模板繼續(xù)擴(kuò)增SRY基因編碼區(qū)，使SRY基因編碼區(qū)兩端帶上酶切位點(diǎn)；將獲得的PCR產(chǎn)物和pET-28a(+)載體同時(shí)進(jìn)行XhoⅠ、EcoRⅠ雙酶切，并用T4 DNA連接酶連接兩種酶切產(chǎn)物，構(gòu)建表達(dá)載體pET-28a/SRY；將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)，用I

7、PTG對(duì)含有pET-28a/SRY表達(dá)載體的E.coli BL21(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)，使其表達(dá)目的蛋白SRY，對(duì)表達(dá)結(jié)果進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在28 kDa處出現(xiàn)一條濃度較大的條帶，表明目的蛋白獲得表達(dá)。 本實(shí)驗(yàn)利用現(xiàn)代分子生物技術(shù)對(duì)SRY基因進(jìn)行了原核表達(dá)，獲得了完整的SRY蛋白并對(duì)其進(jìn)行了純化和鑒定。實(shí)驗(yàn)所得的各種數(shù)據(jù)，為以后的真核表達(dá)、抗性分析以及診斷試劑的研制提供了具有參考價(jià)值的數(shù)據(jù)，并為今后SRY蛋白的結(jié)構(gòu)