水稻miR393a-OsTIR1模塊在種子萌發(fā)時胚芽鞘和胚根中的時空表達模式及其功能研究.pdf

1、miRNA393是植物中一個保守的microRNA家族，其功能研究主要包括植物免疫反應、生長發(fā)育和脅迫反應三個方面。迄今，miR393/靶基因表達在種子萌發(fā)中的調(diào)控機制和生物學功能尚無報道。水稻是重要的禾本科作物，具有能在水淹條件下種子萌發(fā)和生長的獨特生長習性。其中空結構的胚芽鞘通過不斷伸長至氧氣充足的水面，以獲得種子萌發(fā)所需的氧氣，為水稻提供了一個水淹環(huán)境下的生存機制。我們前期實驗發(fā)現(xiàn)水稻miR393的靶基因是生長素受體基因OsT1R

2、1和OsAFB2，且miR393a在胚芽鞘中強表達，在此基礎上，我們將進行miR393a/靶基因在水淹條件下種子萌發(fā)中的表達與功能研究。本文以水稻為研究材料，構建了一系列miR393及其靶基因表達的轉基因株系，希望通過對其轉錄位點、表型及調(diào)控機制的研究，探索miR393a/OsT1R1在水稻種子萌發(fā)時胚芽鞘和胚根生長中的作用。獲得主要實驗結果如下：
　　一、在轉錄活性上的特征
　　(1) OsTIR1與OsAFB2的轉錄活性

3、部位不同。OsTIR1轉錄活性主要在主根、不定根和冠根的根尖，以及幼嫩的穎殼、葉舌和節(jié)中。而OsAFB2則主要在幼嫩的穎殼、葉節(jié)及節(jié)的部位。
　　(2)在種子萌發(fā)初期，MIR393a和Os TIR1的轉錄在不同組織（盾片，胚根，胚芽鞘，側根）呈現(xiàn)重疊、互補、相鄰的三種空間對應特點。
　　(3)水稻胚芽鞘氣孔由一對腎形的保衛(wèi)細胞構成，不同于葉片氣孔中典型的啞鈴型保衛(wèi)細胞。啟動子分析發(fā)現(xiàn)MIR393a在氣孔形成早期的擬分生組織（

4、meristemoid）中強烈轉錄，暗示miR393可能參與了氣孔發(fā)育的調(diào)控。指示生長素反應的DR5啟動子元件在氣孔發(fā)育的整個過程中都有轉錄活性，在成熟的氣孔保衛(wèi)細胞中最強。
　　二、對水稻萌發(fā)階段生長發(fā)育及相關基因的影響
　　(1) miR393表達促進水稻萌發(fā)初期胚根的生長，并抑制側根的生長。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，MIR393過表達株系的胚根伸長區(qū)的長度增長，細胞數(shù)目增多，而MIM393株系伸長區(qū)變短，細胞數(shù)減少。
　　(

5、2)過量表達miR393抑制胚芽鞘和胚芽鞘頂端氣孔的生長，并使胚芽鞘中的細胞壁松弛因子(Expansin)基因EXPA4，EXPA7和EXPB12基因的轉錄水平下降。
　　(3)經(jīng)氣相色譜-質譜聯(lián)用(GC-MS)法對游離生長素含量的測定結果顯示，miR393促進胚芽鞘中游離生長素的積累。同時qRT-PCR結果顯示過表達miR393可以提高胚芽鞘中生長素合成關鍵基因Os YUCCA1和Os YUCCA4的轉錄水平。
　　三、在

6、水淹條件和ABA處理中的調(diào)控機制
　　(1)水淹(submergence)減弱了MIR393口在胚芽鞘尖端和其上氣孔中的轉錄活性，并增強了其中的DR5反應。
　　(2) ABA處理抑制胚芽鞘生長，增強了MIR393a在胚芽鞘尖端和氣孔中的轉錄活性，并減弱了其中的DR5反應。ABA對水稻胚芽鞘生長的抑制作用，很可能與EXPA2和EXPA4有關。
　　(3) Northern blot結果顯示，OsTIR1可以正向反饋調(diào)節(jié)