利用基因芯片技術(shù)篩選敵敵畏中毒腦損傷的相關(guān)基因.pdf

1、目的：從急性敵敵畏中毒導(dǎo)致腦損傷的模型大鼠和正常大鼠的海馬組織中提取總RNA，與構(gòu)建的敵敵畏中毒腦損傷相關(guān)基因表達(dá)譜芯片進行雜交，找出差異表達(dá)基因，從分子水平探討有機磷中毒致腦損傷的機制，為臨床救治提供線索。 方法：實驗采用以核酸雜交為基礎(chǔ)的基因芯片技術(shù)尋找差異表達(dá)基因。從中外文獻(xiàn)中查找大鼠海馬中與抽搐、神經(jīng)毒素中毒有關(guān)的基因，在基因庫(Genebank)中找出其mRNA序列，用探針設(shè)計軟件處理這些基因序列，比對核苷酸序列(Nu

2、cleotideblast)從中找出符合基因芯片探針條件的mRNA片段作為寡核苷酸探針。用合成儀合成探針，并與點樣液等比例混勻后用點樣儀將探針按一定順序點在醛基修飾的玻璃片上制成寡核苷酸芯片。每次取體重160-200g的Wistar大鼠4只，雌雄各半，隨機分為2組，即實驗組和對照組，實驗組大鼠按照13mg/kg的劑量皮下注射敵敵畏標(biāo)準(zhǔn)品，對照組皮下注射相同體積的生理鹽水。中毒大鼠發(fā)生強直痙攣性抽搐20分鐘后斷頭活殺，對照組在相應(yīng)時間點活

3、殺，分別取海馬組織，提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄并熒光標(biāo)記后與構(gòu)建的芯片進行雜交。雜交后的芯片經(jīng)過洗滌、晾干后用掃描儀進行掃描，對獲取的圖像信息進行分析，尋找出表達(dá)水平發(fā)生了變化的基因，并對其功能進行分析。從差異表達(dá)基因中挑選兩條進行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增，將擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察所選基因在實驗組和對照組中的表達(dá)有無差異，表達(dá)變化的情況和基因芯片的結(jié)果是否一致，從而對基因芯片的結(jié)果進行驗證。 結(jié)果：實驗組大鼠都能在給藥后3

4、-5分鐘發(fā)生強直痙攣性抽搐，并能持續(xù)存活20分鐘以上，成功的建立了急性敵敵畏中毒大鼠模型。電泳結(jié)果和紫外分光光度計檢測的結(jié)果表明，從大鼠海馬中抽提的總RNA，無論實驗組還是對照組，其完整性和純度都是符合實驗要求的。依據(jù)文獻(xiàn)報道，找出了40條表達(dá)可能發(fā)生變化的基因探針，將2條水稻基因探針作為陰性對照，和5條大鼠看家基因探針共同構(gòu)成包含50條探針的基因芯片。將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并用雙色熒光標(biāo)記后與芯片雜交，找出了8條差異表達(dá)基因，分別

5、是：MT-1、Ho-1、AceRM5、GABAR-B3、SOD、MaoA、Scg-10、Chrna-7。這些基因的表達(dá)都發(fā)生了上調(diào)，這與文獻(xiàn)的報道是一致的。RT-PCR的結(jié)果表明實驗組海馬組織內(nèi)SOD、HO-1的表達(dá)明顯上調(diào)，與對照組比較，其差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，這與基因芯片的檢測結(jié)果是一致的。 結(jié)論：基因芯片技術(shù)能夠快速、有效、大規(guī)模篩選差異表達(dá)的基因，有傳統(tǒng)的研究差異表達(dá)基因的方法無法比擬的優(yōu)點：高通量同步分析、全自動快速分

6、析、高靈敏度精確分析。同時，芯片上的每一個探針都嚴(yán)格依照堿基互補配對原則與相應(yīng)基因進行雜交，只有一個差異堿基的基因也會表現(xiàn)出雜交信號的不同。因此，我們選擇該方法對有機磷化合物中毒導(dǎo)致驚厥的大鼠和正常對照大鼠的海馬組織之間差異表達(dá)基因進行篩選和比較。本實驗證實在敵敵畏中毒誘發(fā)驚厥的大鼠海馬中發(fā)生了基因調(diào)控表達(dá)的變化。對這些表達(dá)發(fā)生變化的基因功能進行文獻(xiàn)檢索，提示這些基因與膽堿能系統(tǒng)、煙堿能系統(tǒng)的過度興奮、腦組織缺血缺氧、氧自由基超負(fù)荷、抑