鹽負荷誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷的時相特征及機制.pdf

1、目的:探討高鹽誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷的時相特征及機制,以闡明鹽在高血壓等血管內(nèi)皮功能障礙性疾病中的意義。
　　方法:體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞株,選第3—9代細胞用于實驗。將人臍靜脈內(nèi)皮細胞與加載鹽負荷的RPMI1640培養(yǎng)基(氯化鈉終濃度提高30mmol/L)共同孵育不同時間(6h、12h、24h、48h)作為測定組;將與測定組等體積的D-Hank’S液代替NaCl加入細胞培養(yǎng)液中,培養(yǎng)細胞48h,作為空白對照組;應(yīng)用等毫摩爾甘

2、露醇代替氯化鈉培養(yǎng)細胞48h,并檢測各項指標以排除實驗干擾因素。細胞爬片并進行HE染色,于顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化;CCK-8試劑比色法檢測細胞的生長活性;酶標儀檢測乳酸脫氫酶漏出量;采用一氧化氮試劑盒(硝酸還原酶法)比色法檢測細胞培養(yǎng)液中一氧化氮的含量;生化法檢測NOS活性;細胞爬片,免疫細胞化學技術(shù)觀察 eNOS和iNOS在蛋白水平的表達;采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)觀察eNOS和iNOS在基因水平的表達。實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(

3、`x±s)表示,使用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。
　　結(jié)果:鹽負荷能導(dǎo)致人臍靜脈內(nèi)皮細胞發(fā)生形態(tài)學改變和凋亡,細胞的生長活性受到抑制,細胞LDH漏出量增加,且呈時間效應(yīng)關(guān)系;鹽負荷呈時間依賴性地誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液中一氧化氮的含量增加,于24h達高峰;鹽負荷能抑制內(nèi)皮型一氧化氮合酶的活性,及其在蛋白水平和基因水平的表達,且呈時間依賴性;鹽負荷呈時間依賴性地引發(fā)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的活性增強,及其在蛋白水平和基因水平的表達增

4、加,于24h時達高峰。通過應(yīng)用等毫摩爾甘露醇代替氯化鈉培養(yǎng)細胞并對各項指標進行檢測,證明一氧化氮、LDH、eNOS和iNOS的改變不是由于加載鹽負荷后滲透壓改變而引起的。
　　結(jié)論:1、鹽負荷能直接誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷。2、鹽負荷誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞發(fā)生損傷的機制可能是:eNOS的活性及表達受到抑制,生理性一氧化氮的合成減少,內(nèi)皮細胞出現(xiàn)損傷;同時,鹽負荷誘導(dǎo)iNOS的活性及表達增強,產(chǎn)生大量病理性的一氧化氮,出現(xiàn)一氧化氮代謝