二甲雙胍和胰島素對胰腺癌細胞microRNAs的影響及相關研究.pdf

1、目的：①研究二甲雙胍和胰島素或其類似物對人胰腺癌細胞miRNAs表達的影響。②體外實驗研究明顯差異表達的miRNA對人胰腺癌細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移能力的影響。③預測并驗證明顯差異表達miRNA的靶基因。④動物實驗研究二甲雙胍和胰島素或其類似物對胰腺癌裸鼠皮下移植瘤生長的影響,及穩(wěn)定上調明顯差異表達的miRNA對裸鼠胰腺癌皮下移植瘤生長和體內(nèi)轉移能力的影響。
　　方法：①采用Exiqon miRCURYTM LNA miRNA定

2、量PCR芯片檢測一定濃度二甲雙胍或甘精胰島素對人胰腺癌Sw1990細胞miRNA表達譜的影響,并在不同的胰腺癌細胞、不同類型胰島素、不同藥物濃度和不同作用時間的條件下,采用Stem-loop定量PCR方法驗證芯片結果。②選定差異表達最明顯的miRNA,采用siRNA干擾技術明顯上調或下調該miRNA,檢測其對胰腺癌細胞生物學功能的影響:CCK8方法檢測細胞增殖;Transwell小室檢測細胞侵襲、遷移;流式細胞術檢測細胞凋亡。③根據(jù)多個

3、權威預測網(wǎng)站預測該miRNA的靶基因,采用雙熒光素酶報告基因實驗、定量PCR及Westemblot實驗進行驗證。④構建Sw1990細胞裸鼠皮下移植瘤模型,檢測二甲雙胍和甘精胰島素對腫瘤生長影響;構建該miRNA的慢病毒載體,轉染Sw1990細胞后篩選穩(wěn)定轉染細胞,以穩(wěn)定轉染該miRNA細胞構建裸鼠皮下移植瘤和尾靜脈轉移瘤模型,檢測該miRNA在體內(nèi)對腫瘤生長及轉移的影響。
　　結果：①miRNA定量PCR芯片結果表明二甲雙胍可上調

4、Sw1990細胞中9種miRNA的表達(≥2倍),miR-26a、miR-192和let-7c為上調最明顯的三個miRNA;甘精胰島素可上調Sw1990細胞中10個miRNA的表達(≥2倍),下調2個miRNA的表達(≥2倍),miR-95、miR-134和miR-34c-3p為調節(jié)最明顯的三個miRNA。Stem-loop定量PCR表明在Sw1990和Panc-1細胞中,二甲雙胍可以劑量依賴的形式上調miR-26a、miR-192和l

5、et-7c的表達,但未見明顯的時間依賴關系;甘精胰島素和地特胰島素明顯上調了miR-95和miR-134的表達,但對miR-34c-3p的表達無顯著影響,其中miR-134的表達呈現(xiàn)劑量依賴關系;普通胰島素和賴脯胰島素未明顯改變兩種胰腺癌細胞中miR-95、miR-134和miR-34c-3p的表達。②瞬時轉染miR-26a可促進Sw1990和Pane-1細胞的凋亡,抑制其增殖、侵襲和遷移能力;轉染miRNA-26a抑制劑則可獲得相反的

6、效果。瞬時轉染miR-95可減少Sw1990和Panc-1細胞的凋亡,增強其增殖、侵襲和遷移能力;轉染miR-95抑制劑可獲得相反的效果。⑨雙熒光素酶實驗、Western blot及定量PCR表明高遷移率族蛋白A1(HMGA1)為miR-26a的直接靶基因。④二甲雙胍可抑制Sw1990裸鼠皮下移植瘤的生長,而甘精胰島素對裸鼠皮下移植瘤的生長無顯著影響。采用穩(wěn)定轉染miR-26a和miR-95的Sw1990細胞構建裸鼠皮下移植瘤和尾靜脈轉

7、移模型,miR-26a可抑制腫瘤的生長和轉移,miR-95則可促進腫瘤的生長和轉移。
　　結論：①二甲雙胍可顯著增高胰腺癌Sw1990和Panc-1細胞中miR-26a的表達,而甘精胰島素和地特胰島素則顯著增高了Sw1990和Panc-1細胞中miR-95的表達。②體內(nèi)和體外實驗均表明miR-26a可抑制胰腺癌的增殖和轉移,而miR-95則可促進胰腺癌的增殖和轉移。胰腺癌細胞miRNA的相關變化可能是二甲雙胍、甘精胰島素和地特胰島