SARS-CoV S1蛋白在哺乳動物細胞的表達和純化.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:引起嚴重急性呼吸綜合癥(severeacuterespiratorysnydrome,SARS)的病原體SARS冠狀病毒是一種新型的冠狀病毒。Spike(S)蛋白為Ⅰ型跨膜蛋白,是SARS冠狀病毒表面的最重要的膜蛋白,具有與受體結合的功能和促進病毒與細胞膜融合的作用,它與病毒的致病性及組織親嗜性密切相關,可能是病毒誘發(fā)機體免疫系統(tǒng)生成中和抗體的主要抗原蛋白。S蛋白可以分為兩個結構域:S1和S2。S1蛋白上存在與受體結合的位點,S2

2、與病毒外殼膜和宿主細胞膜的融合有關.本研究的目的在于構建能在真核細胞中高量表達的S1重組融合蛋白質粒。并在哺乳動物細胞中表達,再加以純化獲得具有生物活性的重組融合蛋白。為SARS機理探討和疫苗研究奠定實驗基礎。 方法:利用自行設計的引物,以包含全長SARS-CoVS蛋白基因的質粒(PUC18S)為模板進行PCR反應,擴增出SARS-CoVS1蛋白基因序列,與分泌序列CD5L和人IgGFc段一起連接到真核表達載體pEAK12中。構

3、建能在哺乳動物細胞中表達出帶有人IgGFc標簽的S1融合蛋白的質粒。將構建成功的質粒轉染293E細胞,通過嘌呤霉素藥物篩選出整合到細胞基因組,得到能高量表達S1融合蛋白的細胞株。經westernblotting鑒定蛋白,純化SARS-CoVS1融合蛋白,用流式細胞技術鑒定了其生物活性。 結果:構建出的真核表達質粒,經酶切和測序鑒定后,插入片斷準確無誤。并篩選出穩(wěn)定表達分泌型SARS-CoVS1融合蛋白的細胞株。經純化出的SARS

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