KLF4在內(nèi)皮細胞中的表達及其對vWF、PAI-1的影響.pdf

1、血管內(nèi)皮細胞是構(gòu)成血管壁的主要細胞成分，不僅參與創(chuàng)傷、休克、感染、心血管疾病、腫瘤等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展，而且在血管通透性屏障、免疫防御及炎癥反應中起著極為重要的作用。生理條件下，血管內(nèi)皮細胞通過釋放內(nèi)皮衍生松弛因子(EDRF)、血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)和組織型纖溶酶原激活物(t-PA)等各種活性物質(zhì)，抑制血小板聚集、血液凝固以及促進纖溶，防止血栓形成，從而維持血流通暢；在IL-1β、LPS、TNF—α等炎性因子的刺激下，血管內(nèi)皮細胞則可受

2、損，內(nèi)皮細胞釋放的促栓物質(zhì)和抑栓物質(zhì)失衡，抗血栓能力減弱，促進血栓形成。 人KLF4基因定位于9q31，其蛋白質(zhì)由470個氨基酸構(gòu)成。KLF4在體內(nèi)分布廣泛，參與細胞凋亡、增殖、分化以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，其調(diào)節(jié)機制可能與乙酰化修飾有關(guān)。1998年，Yet等證實KLF4在人主動脈和臍靜脈的內(nèi)皮細胞中表達，影響內(nèi)皮細胞炎性調(diào)節(jié)因子的釋放，具有抗炎作用。 因此，明確KLF4在炎性因子刺激內(nèi)皮細胞中的作用，探索KLF4在內(nèi)皮細胞

3、血栓調(diào)節(jié)中的作用和可能機制，對闡明炎性因子誘導血栓形成的機制提供實驗依據(jù)。 目的: 本課題擬通過體外培養(yǎng)人原代臍靜脈內(nèi)皮細胞，IL-1β和TNF—α為炎性刺激因子，觀察KLF4、vWF、PAI-1在內(nèi)皮細胞中的表達變化。采用同源重組方法構(gòu)建攜帶反義KLF4基因腺病毒，觀察干擾內(nèi)皮細胞中KLF4表達后，對炎性因子誘導的內(nèi)皮細胞中vWF、PAI-1的影響，明確KLF4對血栓形成關(guān)鍵物質(zhì)vWF、PAI-1基因表達的調(diào)節(jié)，闡明KLF4在

4、內(nèi)皮細胞血栓調(diào)節(jié)中的作用，并初步探討KLF4影響內(nèi)皮細胞抗栓作用的具體作用機制。 方法: 采用胰蛋白酶消化法，從新鮮臍靜脈分離和培養(yǎng)原代人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)，通過形態(tài)學和流式細胞儀方法進行鑒定。炎性刺激因子IL-1β(2.5ng/mL)、TNF—α(10ng/mL)分別刺激HUVECs2h、4h后，以正常HUVECs為對照，提取細胞RNA和蛋白。采用Real—timePCR、Westernblot、激光共聚焦顯微鏡技

5、術(shù)觀察臍靜脈內(nèi)皮細胞中KLF4、PAI-1和vWFmRNA、蛋白的表達。 通過同源重組方法構(gòu)建Ad—反義KLF4腺病毒。將KLF4基因片段反向克隆到重組腺病毒載體Ad—Easy系統(tǒng)中的穿梭質(zhì)粒pshuttle—CMV的多克隆位點(multiple cloning site，MCS)，構(gòu)建出攜帶反義KLF4基因片段的重組穿梭質(zhì)粒pshuttle—CMV—反義KLF4；再將pshuttle—CMV—反義KLF4與重組腺病毒載體Ad—

6、Easy系統(tǒng)中的骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在大腸桿菌BJ5183內(nèi)進行同源重組。酶切線性化重組載體并轉(zhuǎn)染293細胞，經(jīng)293細胞包裝生成攜帶反義KLF4基因片段的重組腺病毒Ad—反義KLF4。將重組腺病毒Ad—反義KLF4按照不同濃度感染人原代臍靜脈內(nèi)皮細胞，確定最佳感染率。采用Real—timePCR、Western blot方法觀察重組腺病毒Ad—反義KLF4對內(nèi)皮細胞中KLF4表達的抑制效果。 重組腺病毒Ad—反義KLF4

7、感染內(nèi)皮細胞48h后，IL-1β刺激4h，提收取細胞RNA和蛋白。同時，采用Ad—GFP病毒作為對照。Real—timePCR檢測內(nèi)皮細胞中KLF4、PAI-1、vWFmRNA表達；Western blot檢測KLF4、PAI-1蛋白的表達；激光共聚焦顯微鏡觀察KLF4、vWF表達和定位。免疫共沉淀技術(shù)觀察KLF4乙?；阶兓?。觀察抑制KLF4表達對炎性因子刺激內(nèi)皮細胞中PAI-1和vWF表達的影響，以及可能的作用機制。各組實驗數(shù)據(jù)以

8、均數(shù)±標準差(x±s)表示。兩組數(shù)據(jù)間的差異用方差分析。P＜0.05為差異有顯著性。 結(jié)果: 1．選用新鮮臍帶作為血管內(nèi)皮細胞的來源，采用0.25％胰蛋白酶消化法分離原代臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)，通過形態(tài)學和細胞表面特異性標記的方法進行鑒定，倒置相差顯微鏡下觀察細胞呈梭狀或鵝卵石樣鑲嵌排列，單層生長，胞漿豐富，胞核可見，為圓形或橢圓形；流式細胞儀觀察到大部分細胞均可表達vWF抗原和CD31抗原，證實所分離和培養(yǎng)的細

9、胞為HUVEC。 2．KLF4在正常臍靜脈內(nèi)皮細胞中表達，定位于細胞核中。炎性因子增強內(nèi)皮細胞中KLF4的表達。隨著刺激時間的延長，KLF4表達逐漸增強。明顯高于正常HUVECs中KLF4表達，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。 3．IL-1β、TNF—α刺激內(nèi)皮細胞中vWF、PAI-1表達，與正常HUVECs中vWF、PAI-1表達比較，差異具有顯著性(P＜0.05)。炎性因子刺激4h組中vWF、PAI-1表達高于其

10、在2h組中表達(P＜0.05)。其中以IL-1β刺激組中vWF、PAI-1表達增加明顯，均高于TNF—α刺激組，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 4．成功地構(gòu)建出攜帶反義KLF4基因片段的重組腺病毒Ad—反義KLF4，經(jīng)菌液PCR、酶切和DNA測序鑒定重組腺病毒完全正確，并在HEK293A細胞中包裝、擴增腺病毒，獲得高濃度Ad—反義KLF4腺病毒。 5．熒光顯微鏡下觀察，以MOI值200的Ad—GFP感染HUVECs

11、48h后，近90％內(nèi)皮細胞表達綠色熒光。故選擇MOI值200的Ad—反義KLF4腺病毒感染HUVECs細胞，觀察KLF4對內(nèi)皮細胞中vWF、PAI-1的調(diào)節(jié)。 6．MOI值200的重組腺病毒Ad—反義KLF4感染HUVECs后可使KLF4表達明顯下降(0.44±0.06)，與Ad—GFP組(0.61±0.01)和未感染組(0.59±0.01)比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而Ad—GFP組與未感染組之間差異無統(tǒng)計學意義

12、(P＞0.05)。 7．Ad—反義KLF4感染HUVECs后，vWF、PAI-1表達隨之明顯增加(1.17±0.05，0.73±0.01)，與感染Ad—GFP組(1.04±0.03，0.67±0.04)相比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。IL-1β刺激Ad—反義KLF4感染HUVECs組，vWF、PAI-1表達增加顯著(1.90±0.11，0.97±0.02)，明顯高于單純炎性刺激組(1.22±0.06，0.86±0.0

13、4)(P＜0.05)。 8．炎性因子IL-1β刺激內(nèi)皮細胞KLF4乙?；皆黾?。 結(jié)論: 1．炎性因子增強內(nèi)皮細胞中KLF4表達。 2．IL-1β、TNF—α刺激內(nèi)皮細胞vWF、PAI-1表達。 3．抑制KLF4表達后，炎性因子誘導vWF、PAI-1表達增強，內(nèi)皮細胞的促栓作用增強。 4．KLF4具有抑栓作用，KLF4乙?；赡苁瞧錂C制之一。 5．KLF4可能是內(nèi)皮細胞抗栓作用的