人胚胎干細(xì)胞來(lái)源CD34+細(xì)胞與臍血來(lái)源CD34+細(xì)胞EMT相關(guān)分子表達(dá)的比較.pdf

1、造血干細(xì)胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)是治療許多血液系統(tǒng)疾病的重要手段，目前常用的移植供源包括骨髓，外周血和臍血。但是，移植技術(shù)的開(kāi)展受到供源不足和配型成功率低的限制。因此，開(kāi)發(fā)新的移植供源具有重要意義。胚胎干細(xì)胞可能滿(mǎn)足這項(xiàng)需求。臨床上移植開(kāi)展常將CD34抗原作造血干細(xì)胞的標(biāo)記，體外研究表明通過(guò)誘導(dǎo)自發(fā)分化，或者與S17，OP9等基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的方法已經(jīng)能夠?qū)⑴咛ジ杉?xì)

2、胞分化為CD34+細(xì)胞。但是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，這些分化的CD34+細(xì)胞并不能完全模擬臍血等移植供源的功能。臍血因其具有相對(duì)容易獲得性，低的感染率和低的移植物抗宿主反應(yīng)被應(yīng)用到移植上。那么研究胚胎干細(xì)胞來(lái)源的CD34+細(xì)胞與臍血來(lái)源的CD34+細(xì)胞的差異對(duì)于了解胚胎干細(xì)胞分化機(jī)制非常重要。體內(nèi)研究表明，在胚胎發(fā)育過(guò)程中，造血干細(xì)胞主要由中胚層發(fā)育而來(lái)，產(chǎn)生造血干細(xì)胞的主要場(chǎng)所是主動(dòng)脈-性腺-中腎區(qū)(aorta-gonad-mesonephro

3、s，AGM)和胎肝(fetal liver，F(xiàn)L)。在胎肝產(chǎn)生造血干細(xì)胞過(guò)程中，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)機(jī)制起到了重要的作用。在體外研究中，關(guān)于EMT機(jī)制在胚胎干細(xì)胞向CD34+細(xì)胞分化中作用尚無(wú)定論。因此，探討EMT機(jī)制在胚胎干細(xì)胞向CD34+分化過(guò)程的作用將會(huì)有一定的價(jià)值。已有研究表明，在胚胎干細(xì)胞分化的過(guò)程中干細(xì)胞標(biāo)記會(huì)減少或消失，這些標(biāo)記的減少或消失是否也與CD34

4、有關(guān)聯(lián)呢？在此假設(shè)的基礎(chǔ)上，我們研究了胚胎干細(xì)胞向CD34+細(xì)胞分化過(guò)程中具有代表性的干細(xì)胞標(biāo)記NANOG;和EMT相關(guān)的重要的鈣粘蛋白E-cadherin和N-cadherin;EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail1，Snail2，Zeb1，Zeb2的表達(dá)變化，并比較了純化后的胚胎干細(xì)胞來(lái)源和臍血來(lái)源的CD34+細(xì)胞以上分子的表達(dá)變化。研究發(fā)現(xiàn)
　　1.胚胎干細(xì)胞分化為CD34+細(xì)胞過(guò)程中NANOG的表達(dá)水平逐漸降低;純化后的胚胎干細(xì)胞

5、來(lái)源的CD34+（human embryonic stem cell-derived CD34+，hESCs-CD34+）細(xì)胞的NANOG水平高于純化后臍血來(lái)源CD34+(umbilical cord blood-derived CD34+，UCB-CD34+)細(xì)胞。即隨著胚胎干細(xì)胞向CD34+細(xì)胞分化，hESCs-CD34+細(xì)胞NANOG表達(dá)逐漸下降，但仍然高于UCB-CD34+細(xì)胞。
　　2.胚胎干細(xì)胞分化為CD34+細(xì)胞過(guò)程

6、中，EMT相關(guān)上皮性鈣粘蛋白E-cadherin表達(dá)逐漸下降;間質(zhì)性鈣粘蛋白N-cadherin逐漸上升;EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因Snail1，Snail2，Zeb1，Zeb2表達(dá)水平逐漸上升。純化后hESCs-CD34+細(xì)胞E-cadherin的表達(dá)高于純化后UCB-CD34+細(xì)胞;N-cadherin的表達(dá)低于純化后UCB-CD34+細(xì)胞;轉(zhuǎn)錄因子Snail1，Snail2，Zeb1，Zeb2的表達(dá)低于純化后UCB-CD34+細(xì)胞。即隨著胚

7、胎干細(xì)胞向CD34+細(xì)胞分化，hESCs-CD34+細(xì)胞E-cadherin表達(dá)逐漸下降，但仍然高于UCB-CD34+細(xì)胞;N-cadherin和轉(zhuǎn)錄因子Snail1，Snail2，Zeb1，Zeb2表達(dá)逐漸上升，但仍低于UCB-CD34+細(xì)胞。
　　第一部分人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化為CD34+細(xì)胞
　　目的: 研究人胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)方法以及用不同方法將hESC-H9誘導(dǎo)分化為CD34+細(xì)胞
　　方法: 以小鼠胚胎成

8、纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)作為滋養(yǎng)層，將人胚胎干細(xì)胞細(xì)胞系hESC-H9進(jìn)行二維培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行干性標(biāo)記時(shí)相專(zhuān)一性抗原(stage specific embryonicant，SSEA) SSEA-4，腫瘤識(shí)別抗原(tumor rejectionantigen，Tra)Tra-1-81以及堿性磷酸酶染色檢測(cè);利用胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)自發(fā)分化和與基質(zhì)細(xì)胞OP9共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化的方法得到CD34+細(xì)

9、胞;對(duì)誘導(dǎo)過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)CD34變化進(jìn)行流式分析和Real-time PCR檢測(cè)。
　　結(jié)果: hESC-H9表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記SSEA-4及Tra-1-81，堿性磷酸酶染色陽(yáng)性;以自發(fā)分化和OP9誘導(dǎo)分化的方法可以得到CD34+細(xì)胞，CD34+細(xì)胞比例在培養(yǎng)第8天至第10天為3％-5％，達(dá)到最大值;用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，OP9誘導(dǎo)分化方法得到的CD34+細(xì)胞分群更為明顯，Real-time PCR檢測(cè)證實(shí)CD34+細(xì)胞變化趨勢(shì)。

10、r>　　第二部分人胚胎干細(xì)胞來(lái)源CD34+細(xì)胞和臍血來(lái)源CD34+細(xì)胞NANOG表達(dá)比較
　　目的: 研究hESC-H9誘導(dǎo)分化為CD34+細(xì)胞過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)、hESCs-CD34+細(xì)胞與UCB-CD34+細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)記NANOG的表達(dá)比較
　　方法: 在hESC-H9誘導(dǎo)分化為CD34+細(xì)胞過(guò)程中，收集分化不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞，比較NANOG的變化;hESC-H9誘導(dǎo)分化為CD34+細(xì)胞D8收集hESCs-CD34+細(xì)胞，用

11、流式細(xì)胞儀分選純化后hESCs-CD34+細(xì)胞;從臨床收集臍血標(biāo)本，用磁珠分選的方法獲得純化后UCB-CD34+細(xì)胞，比較兩者來(lái)源CD34+細(xì)胞中NANOG的表達(dá)差異。
　　結(jié)果: 在hESC-H9誘導(dǎo)分化CD34+細(xì)胞過(guò)程中，NANOG的表達(dá)量逐漸下降;純化后hESCs-CD34+細(xì)胞的NANOG的表達(dá)較UCB-CD34+細(xì)胞高。
　　第三部分人胚胎干細(xì)胞來(lái)源CD34+細(xì)胞分選和臍血來(lái)源CD34+細(xì)胞EMT相關(guān)分子表達(dá)比較

12、
　　目的: 研究hESC-H9誘導(dǎo)分化為CD34+細(xì)胞過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)、hESCs-CD34+細(xì)胞與UCB-CD34+細(xì)胞EMT相關(guān)分子的表達(dá)比較
　　方法: 在hESC-H9誘導(dǎo)分化為CD34+細(xì)胞過(guò)程中，收集分化不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞，比較EMT相關(guān)分子E-cadherin、N-cadherin、Snail1、Snail2、Zeb1和Zeb2的表達(dá)變化;hESC-H9誘導(dǎo)分化后D8收集hESCs-CD34+細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀

13、分選純化后hESCs-CD34+細(xì)胞;從臨床收集臍血標(biāo)本，用磁珠分選的方法獲得純化后UCB-CD34+細(xì)胞，比較兩者來(lái)源CD34+細(xì)胞EMT相關(guān)分子E-cadherin、N-cadherin、Snail1、Snail2、Zeb1和Zeb2的表達(dá)差異。
　　結(jié)果: 在hESC-H9誘導(dǎo)分化CD34+細(xì)胞過(guò)程中，隨著分化時(shí)間的延長(zhǎng)，上皮性標(biāo)記E-cadherin的表達(dá)量逐漸下降;間質(zhì)性標(biāo)記N-cadherin逐漸上升;EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因

14、子Snail1、Snail2、Zeb1、Zeb2的表達(dá)量逐漸上升;純化后hESCs-CD34+細(xì)胞的E-cadherin的表達(dá)水平較UCB-CD34+細(xì)胞高，N-cadherin及轉(zhuǎn)錄因子Snail1、Snail2、Zeb1、Zeb2的表達(dá)水平較UCB-CD34+細(xì)胞低。
　　綜上所述，首先，本研究鑒定了hESC-H9的干細(xì)胞特性。其次，通過(guò)誘導(dǎo)自發(fā)分化和與OP9共培養(yǎng)的方法能夠誘導(dǎo)hESC-H9分化為CD34+細(xì)胞。結(jié)果證實(shí)，在

15、誘導(dǎo)分化的過(guò)程中，CD34的表達(dá)逐漸增高;干細(xì)胞標(biāo)記NANOG的表達(dá)逐漸下降;與EMT相關(guān)的上皮性標(biāo)記表達(dá)逐漸下降，間質(zhì)性標(biāo)記表達(dá)逐漸上升，轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)也逐漸上升。最后，比較純化后hESCs-CD34+細(xì)胞和UCB-CD34+細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)純化后hESCs-CD34+細(xì)胞的干細(xì)胞標(biāo)記NANOG，EMT相關(guān)上皮性標(biāo)記E-cadherin，比UCB-CD34+細(xì)胞高，但是間質(zhì)性標(biāo)記及轉(zhuǎn)錄因子比UCB-CD34+細(xì)胞低，提示胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分