PiggyBac轉座系統(tǒng)在斑馬魚研究中的應用及文昌魚Six1基因的克隆和生物信息學分析.pdf

1、隨著斑馬魚基因組測序工作的完成，人們發(fā)現(xiàn)斑馬魚基因與人類基因的保守度高達87％，使得斑馬魚作為一種研究人類基因功能的模式動物越來越受到關注。
　　 轉座子在低等生物轉基因和基因誘變分析中得到了廣泛的應用，對這些生物基因功能的研究起了重要作用。目前用于斑馬魚基因功能研究的轉座子主要是Tol2，結合基因捕獲技術較廣泛的被應用于斑馬魚突變體篩選。Tol2的轉座遵循“切離-粘貼”機制，其插入基因組時會產生插入位點處8個堿基的重復，但其存

2、在切離后留下的痕跡不一的缺點，不易實現(xiàn)對突變表型的回復。
　　 PiggyBac轉座子(PB)是一種來源于鱗翅目昆蟲的DNA轉座子，最初的序列在粉紋夜蛾(Trichoplusiani)細胞系中分離，其轉座遵循“切離-粘貼”機制，PB特異地插入到TTAA四堿基位點，插入的同時在其兩側形成TTAA四堿基重復。它可以從插入位點處精確地切離，不留下任何痕跡，使插入位點完全回復到插入以前的狀態(tài)。該轉座子目前已經開發(fā)成為轉基因昆蟲中應用最為

3、廣泛的載體之一，它己被證明能夠在四個目十數(shù)種昆蟲中轉座。2005年Ding等的研究發(fā)現(xiàn)其也能在脊椎動物如小鼠中實現(xiàn)高效轉座;2006年，F(xiàn)raser等發(fā)現(xiàn)PB轉座子在斑馬魚原代培養(yǎng)細胞及胚胎中均能進行轉座，揭示了PB轉座系統(tǒng)在斑馬魚基因功能研究中具有廣泛的應用前景。
　　 我們對piggyBac(PB)轉座系統(tǒng)中的helper質粒-轉座酶載體質粒(pCMV-hyPBase)和donor質粒-轉座子載體質粒(5'-PTK-3')分

4、別進行了重新構建，得到了一個二元系統(tǒng)。
　　 Helper質粒pCMV-hyPBase-IRES-EGFP構建過程如下:將來源于質粒pPRIG的IRES-EGFP片段插入到XbaI和XhoI雙酶切的質粒pCMV-hyPBase的缺口，從而構建了雙順反子表達載體質粒:pCMV-hyPBase-IRES-EGFP;Helper質粒pZPC0.5-hyPBase-IRES-EGFP構建過程如下:將克隆得到的斑馬魚ZPC0.5啟動子插入

5、到SpeI和EcoRI雙酶切的質粒pCMV-hyPBase-IRES-EGFP缺口，替換掉CMV啟動子，即得到雙順反子表達載體質粒:pZPC0.5-hyPBase-IRES-EGFP。
　　 Donor質粒PTK-mCherry構建過程如下:將以pmCherry-N1質粒為模板克隆得到的mCherry基因片段插入到用NcoI和BclI雙酶切的質粒5'-PTK-3'缺口，構建得到了基因捕獲載體質粒:PTK-mCherry。質粒pC

6、S2+-hyPBase構建過程如下:將來源于質粒pCMV-hyPBase的hyPBase片段插入到用EcoRI和XhoI雙酶切的質粒pCS2+的缺口，即構建了轉座酶hyPBasemRNA合成模板載體質粒pCS2+-hyPBase。
　　 將pCMV-hyPBase-IRES-EGFP質粒載體線性化后顯微注射到斑馬魚單細胞期受精卵中，篩選得到了EGFP遍表達的helper品系轉基因斑馬魚，并且發(fā)現(xiàn)其中一些魚的這一性狀能夠穩(wěn)定傳給F

7、1代，從而得到了此轉基因品系的founder斑馬魚。
　　 以線性化的pCS2+-hyPBase為模板，體外轉錄合成了轉座酶hyPBasemRNA。將此mRNA與基因捕獲載體質粒PTK-mCherry共注射到斑馬魚單細胞期受精卵中，篩選得到了mCherry的表達在時間及空間上均不同的donor品系轉基因斑馬魚，且發(fā)現(xiàn)mCherry在F0代中有將近8％的表達率，證明piggyBac轉座子能夠在斑馬魚中進行有效轉座且捕獲到不同基因，