HCV、HIV單一及合并感染者PBMC中APOBEC3G基因的表達.pdf

1、研究背景：人類免疫缺陷病毒(HIV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染是全球性問題，因兩者具有相同的傳播途徑，合并感染現(xiàn)象相當常見，目前全球大約有4千萬人感染HIV，其中超過1/3患者感染了HCV，在美國估計有30％的HIV感染者合并感染HCV，在西班牙，13萬HIV感染者中至少50％感染者合并HCV感染，在我國經血液感染HIV的患者合并HCV感染率達55.81％-90.36％。HIV、HCV合并感染加速了AIDS和肝損傷的進展，具有協(xié)同致病

2、作用。高效抗逆轉錄病毒治療(HAART)的應用已經顯著降低了艾滋病患者的死亡率和機會性感染等合并癥的發(fā)生，但肝臟病變，尤其HCV合并感染導致的肝臟病變，成為了HIV/AIDS患者死亡的主要原因，所以對HIV/HCV合并感染者進行抗丙型肝炎病毒治療成為近年來頗受關注的問題。無論是HCV單一感染還是HIV/HCV合并感染，IFN-α都是抗HCV的首選藥物，但是因為IFN-α在抗HCV的同時可以減少CD4+T淋巴細胞數(shù)，對于HIV/HCV合并

3、感染的治療方案和時機目前尚無確切定論。因此尋求新的具有抗病毒治療作用的分子一直是HIV、HCV和HIC/HCV合并感染領域的研究熱點。本文對HCV、HIV單一感染和HIV/HCV合并感染患者PBMC中APOBEC3G的表達水平進行研究，并動態(tài)觀察了IFN-α(聚乙二醇干擾素，Pega-IFN-α2a)治療對慢性丙型肝炎患者外周血單個核細胞(PBMC)中APOBEC3G的表達水平的影響，以期為進一步明確APOBEC3G在以上感染中的作用，

4、研究HCV、HIV單一感染及HIV/HCV合并感染時致病的分子機制，為尋求新的抗病毒治療方法提供依據(jù)。
　　 目的：基于APOBEC3G在抗病毒尤其抗HIV方面的重要作用，本研究初步探討HIV、HCV單一感染者及HIV/HCV合并感染者PBMC中APOBEC3G基因的表達，及HCV感染者APOBEC3G表達水平與病毒載量水平和干擾素治療的關系，對進一步闡明APOBEC3G在以上感染中的作用和HCV、HIV及HIV/HCV合并感染

5、時致病的分子機制，尋求新的抗病毒治療方法具有較大的指導意義。本研究主要內容：⑴HCV單一感染者(慢性丙型肝炎患者)PBMC中A3G mRNA及其蛋白的表達水平，A3G mRNA水平與HCV病毒載量的關系；HIV單一感染者和HIV/HCV合并感染者PBMC中A3G mRNA表達水平；⑵干擾素治療的不同時期，慢性丙肝患者PBMC中A3GmRNA的表達及與HCV病毒載量、血漿IFN-α變化的關系。
　　 方法：⑴76例慢性丙型肝炎患者

6、為在廣州市第八人民醫(yī)院感染科就診的病人，診斷符合2004年丙肝防治指南的診斷標準；排除其他病毒感染，包括甲型、乙型、戊型肝炎病毒和巨細胞病毒、EB病毒感染；排除自身免疫性肝炎、酒精性肝病和代謝性肝病；未使用過抗病毒藥物及免疫抑制劑；⑵18例HIV感染者為在廣州市第八人民醫(yī)院感染科就診的AIDS患者，均經過CDC行HIV抗體確證實驗陽性并PCR檢測病毒載量陽性符合HIV感染診斷標準，排除其他病毒感染，包括甲型、乙型、丙型、戊型肝炎病毒和巨

7、細胞病毒、EB病毒感染；排除自身免疫性肝炎、酒精性肝病和代謝性肝??；未使用抗病毒藥物及免疫抑制劑；⑶28例HIV/HCV合并感染者均為在廣州市第八人民醫(yī)院感染科在住院病人，HIV感染經CDC的HIV抗體確證實驗陽性符合HIV感染診斷標準，HCV感染符合2004年丙肝防治指南的診斷標病毒感染，排除甲型、乙型、戊型肝炎病毒感染；⑷20例慢性丙型肝炎患者，抗HCV治療方案為聚乙二醇干擾素(Pega-IFN-α2a，派羅欣)聯(lián)合利巴韋林治療一年

8、，收集系列血清及PBMC標本；⑸嚴格按照入組標準及排除標準，收集標本，各采集外周靜脈血15ml，分離血漿4ml(1ml/支)，-80。C凍存；PBMC5-9×107個(2.5-4.5×107個/支)，液氮凍存。⑹目的基因APOBEC3G和內參基因18s rRNA引物及探針根據(jù)Yuichi Tanaka，et al，2006等的報道序列，分別選擇FAM和HEX進行熒光標記；⑺使用Trizol從PBMC提取RNA，逆轉錄RNA為cDNA，以

9、cDNA為模板，Real-time RCR檢測目的基因及內參基因。⑻Western blotting方法測定PBMC中APOBEC3G蛋白表達量以GAPDH蛋白為內參照，以小鼠抗人GAPDH單克隆抗體和小鼠抗人APOBEC3G多克隆抗體為一抗，HRP標記的抗小鼠IgG為二抗，化學發(fā)光法(ECL)對檢測結果進行顯色，并用Quantity One軟件對結果進行分析。⑻運用實時定量PCR的方法測定外周血上清中HCV-RNA的含量。操作按說明書

10、進行，實驗結束后結果由軟件自動分析得出。⑼ELISA方法測定外周血上清中FN-α的含量，操作按說明書進行，實驗結束后酶標儀測定標準品及樣本的OD值，根據(jù)標準品制定標準曲線，使用Excel軟件計算樣本IFN-α含量(pg/ml)。⑽用SPSS11.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學處理，兩組均數(shù)比較用獨立樣本t檢驗，多組比較采用完全隨機設計方差分析(One way ANOVA)，多重比較采用LSD檢驗，相關性分析用Pearson積矩相關分析，P＜0.

11、05具有被認為具有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：①慢性丙肝患者PBMC中A3G mRNA的表達水平顯著低于健康對照人群(P＜0.01)；血漿中的病毒載量與PBMC中A3G mRNA的表達水平無明顯相關性(R=0.092，P＞0.05)。②以GAPDH蛋白為內參照，Western blotting檢測結果提示，與健康人相比較，慢性丙肝患者治療前PBMC中APOBEC3G蛋白表達水平有下調趨勢，但二者間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

12、③HIV單一感染及HIV/HCV合并感染患者PBMC中A3G mRNA的表達水平HIV單一感染組與健康對照組相比，A3G mRNA表達水平下調，p=0.001＜0.05，差別有統(tǒng)計學意義；HIV/HCV合并感染組與健康對照組比較，A3G mRNA表達水平下調，p=0.030＜0.05，差別有統(tǒng)計學意義。④HIV單一感染組、HIV/HCV合并感染組及HCV單一感染組三組比較，經方差分析，F(xiàn)=3.959，p=0.023＜0.05，三組之間差

13、別有統(tǒng)計學意義，在方差分析情況下進行LSD兩兩比較檢驗：HIV單一感染組與HCV單一感染組比較，p=0.766＞0.05，差別無統(tǒng)計學意義；HIV/HCV合并感染組較HIV單一感染組A3G mRNA表達水平增高，p=0.021＜0.05，差別有統(tǒng)計學意義；HIV/HCV合并感染組較HCV單一感染組A3G mRNA表達水平增高，p=0.019＜0.05，差別有統(tǒng)計學意義。⑤20例入組病例，療程結束后并繼續(xù)隨診，其中13例達到快速病毒學應答

14、(RVR)，20例均達到早期病毒學應答(EVR)和治療結束時病毒學應答(ETVR)，其中11例達到持續(xù)病毒學應答(SVR)，另外9例患者治療結束尚未達到24周仍在隨診。⑥20例HCV感染者干擾素抗病毒治療0周、2周、4周、12周、24周、36周、48周等時間點分別檢測A3G mRNA表達水平，結果顯示治療后2周、4周與0周相比，A3G mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；治療后12周、24周、36周、48周和0周相比，A3

15、G mRNA表達水平均呈現(xiàn)上調趨勢，P值均＜0.001，差異有統(tǒng)計學意義。在接受干擾素治療過程中，血漿病毒載量隨治療快速下降，至12W基本轉陰；血漿中IFN-α含量逐漸上升并維持在較高水平。
　　 結論：⑴HCV感染(慢性丙型肝炎)患者PBMC中APOBEC3G的表達水平明顯降低，但APOBEC3G的表達水平與HCV的復制水平無相關性。⑵HIV、HCV感染者PBMC中APOBEC3G的表達均降低，HCV感染導致APOBEC3G表