褪黑素抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞屏障保護(hù)機(jī)制的研究.pdf

1、目的：第一部分：探討大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞的分離、培養(yǎng)方法和鑒定。
　　 第二部分：探討褪黑素(Melatonin，Mel)通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinase，MMP)-9的表達(dá)和活性，來保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能的作用機(jī)制。
　　 方法：第一部分：取3周齡Wistar大鼠，無菌分離腦組織，采用兩次酶消化和一次密度梯度離心法分離大鼠腦微血管片段后，通過不同的處理方法，接種于35mm

2、培養(yǎng)皿上進(jìn)行原代培養(yǎng)；使用vWF和GFAP抗體來鑒定腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，免疫熒光染色觀察緊密連接蛋白claudin-5在細(xì)胞間的分布；使用α-SMA、NG2、vWF和GFAP抗體來鑒定周細(xì)胞，利用MTT法測定周細(xì)胞的增殖。
　　 第二部分：原代分離培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbilicalveinendothelialcells，HUVECs)，并使用包被小鼠抗人CD31單克隆抗體的免疫磁珠對原代分離的HUVECs進(jìn)一步純

3、化。以小鼠抗人vWF單克隆抗體及FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠熒光二抗鑒定純化后的HUVECs。RT-PCR和Westemblot檢測不同干預(yù)條件下MMP-9、MMP-2、TIMP-1和TIMP-2mRNA和蛋白表達(dá)；明膠酶譜分析不同干預(yù)條件下MMP-9和MMP-2的活性；利用Transwell系統(tǒng)，檢測不同干預(yù)條件下透過單層內(nèi)皮的Na-F來反映MMP-9對內(nèi)皮通透性的影響；用免疫熒光顯微鏡觀察不同干預(yù)條件下內(nèi)皮細(xì)胞黏著連接蛋白VE-鈣粘素(

4、VE-cadherin)和緊密連接蛋白o(hù)ccludin、claudin-5和ZO-1的變化以及核轉(zhuǎn)錄因子p65核轉(zhuǎn)位；使用Westernblot檢測VE-cadherin、occludin和p65的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：第一部分：成功分離培養(yǎng)原代腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞，倒置顯微鏡下內(nèi)皮細(xì)胞呈梭形，匯合后形成典型的“鵝卵石”樣外觀，并通過免疫熒光染色，GFAP表達(dá)陰性，vWF表達(dá)陽性，證實(shí)為微血管內(nèi)皮細(xì)胞；同時(shí)也可以看到cla

5、udine-5連續(xù)完整表達(dá)在細(xì)胞邊緣；倒置顯微鏡下周細(xì)胞胞體大，且表現(xiàn)出很多的突觸，并通過免疫熒光染色證實(shí)為微血管周細(xì)胞。原代周細(xì)胞初始生長速度較緩慢，傳代細(xì)胞36～60h進(jìn)入對數(shù)生長期，72～108h進(jìn)入平臺期。
　　 第二部分：(1)分離培養(yǎng)原代HUVECs，免疫磁珠篩選后能繼續(xù)貼壁生長并傳代，倒置顯微鏡下HUVECs呈鵝卵石狀，vWF免疫熒光染色證實(shí)細(xì)胞確為HUVECs。細(xì)胞呈梭形、圓形或多角形。(2)與對照組相比，IL-

6、1β(10ng/mL)處理組顯著增加了MMP-9mRNA和蛋白的表達(dá)(P＜0.001)，同時(shí)TIMP-1mRNA和蛋白的表達(dá)顯著減少(P＜0.001)，而MMP-2和TIMP-2mRNA和蛋白的表達(dá)沒有明顯變化(P＞0.05)；與IL-1β處理組相比，Mel（10μmol/L）預(yù)處理組顯著抑制了MMP-9mRNA和蛋白的表達(dá)(P＜0.001)，而TIMP-1mRNA和蛋白的表達(dá)顯著增加(P＜0.001)，MMP-2和TIMP-2mRNA

7、和蛋白的表達(dá)沒有明顯變化(P＞0.05)；(3)明膠酶譜分析，與對照組相比，IL-1β處理組的MMP-9酶活性顯著增加(P＜0.001)；與IL-1β處理組相比，Mel預(yù)處理顯著抑制了MMP-9酶活性(P＜0.01)。然而，與對照組相比，IL-1β處理組和Mel預(yù)處理組的MMP-2酶活性無顯著差異(P＞0.05)。(4)Transwell分析內(nèi)皮細(xì)胞屏障對Na-F的通透性的變化，與對照組相比，IL-1β處理組在不同的時(shí)間點(diǎn)顯著增加了內(nèi)皮

8、屏障對Na-F的通透性(P＜0.001)。而與IL-1β處理組相比，褪黑素預(yù)處理組顯著降低了Na-F的通透性(P＜0.001)。(5)熒光顯微鏡觀察：正常匯合后的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)VE-cadherin、occludin、claudin-5和ZO-1呈現(xiàn)出連續(xù)不間斷的狀態(tài)；IL-1β處理組細(xì)胞之間黏附連接蛋白VE-cadherin和緊密連接蛋白o(hù)ccludin、claudin-5和ZO-1在細(xì)胞膜上的表達(dá)下調(diào)，并出現(xiàn)斷裂。Mel(10μmol

9、/L)預(yù)處理后，VE-cadherin、occludin、claudin-5和ZO-1的表達(dá)狀態(tài)得到了改善。WesternBlot結(jié)果表明：與對照組相比，IL-1β處理組HUVECs的VE-cadherin和occludin表達(dá)量下調(diào)。Mel可有效抑制MMP-9導(dǎo)致的VE-cadherin和occludin下調(diào)，但仍低于對照組(P＜0.01)。(6)Westemblot和免疫熒光分析，IL-1β處理組可顯著增加NF-KB/p65核轉(zhuǎn)位。

10、Mel(10μmol/L)預(yù)處理組可以有效抑制這一效應(yīng)。
　　 結(jié)論：第一部分：成功分離出純度較高的大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞；
　　 第二部分：(1)MMP-9破壞了HUVECs黏附連接蛋白VE-cadherin和緊密連接蛋白o(hù)ccludin、claudin-5和ZO-1，使其表達(dá)降低，細(xì)胞間出現(xiàn)縫隙，通透性升高；(2)Mel通過抑制IL-1β誘導(dǎo)的NF-κB/p65信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制了MMP-9活性和表達(dá)的增加，改善了