農(nóng)桿菌介導鐵載體基因IRT1轉(zhuǎn)化八棱海棠的研究.pdf

1、本實驗在實驗室原有八棱海棠再生體系的基礎上，采用了農(nóng)桿菌介導法將IRTI基因轉(zhuǎn)入八棱海棠中，獲得了4個攜帶IRTI基因的八棱海棠株系。同時，本實驗還初步探討了不同繼代次數(shù)對八棱海棠離體培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化的影響。研究結(jié)果如下： 1.以離體培養(yǎng)不同繼代次數(shù)的八棱海棠的芽苗和幼葉為材料，來研究其對離體培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化的影響。研究表明：隨繼代培養(yǎng)次數(shù)的增加，繼代10次和48次的八棱海棠離體增殖倍數(shù)、生根能力、不定芽的再生頻率、每外植體再生芽數(shù)

2、和GUS基因瞬時表達率均顯著高于繼代5次的；繼代10次的增殖倍數(shù)和GUS陽性率明顯多于繼代48次的，其它指標相互間差異不顯著；說明繼代10次的芽苗較適合用于八棱海棠離體培養(yǎng)的外殖體材料，其幼葉較適于遺傳轉(zhuǎn)化研究。 2.本研究在本實驗室蘋果遺傳轉(zhuǎn)化體系的基礎上，通過研究兩種農(nóng)桿菌菌株LBA4404和GV3101、km對八棱海棠繼代苗的影響、km選擇壓的確定、Km加入時間、用加入頭孢的MSo清洗的時間及AS加入的方式對八棱海棠遺傳轉(zhuǎn)

3、化的影響，建立了八棱海棠簡單、高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系：以LBA4404為侵染菌，加入75μmol/L AS的MS0活化菌株，剪取在繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)35d的繼代苗的芽苗，再轉(zhuǎn)接在新的繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)10d的葉片為實驗材料，在加入AS的再生培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3d，用加入頭孢的MS0清洗共培養(yǎng)后的葉片10min，然后轉(zhuǎn)入延后培養(yǎng)基(MS+BA4.0mg/L+NAA0.2mg/L+cb250mg/L)上培養(yǎng)3d，再轉(zhuǎn)到篩選培養(yǎng)基(MS+BA4.0mg/

4、L+NAA0.2mg/L+km25 mg/L+cb250mg/L)上，當再生苗高2cm時，將苗轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)(MS+BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+Km50mg/L)進行選擇培養(yǎng)的遺傳轉(zhuǎn)化體系。 3.實驗分別用兩種菌株同時侵染八棱海棠的葉片，兩種菌株AT126和AT96分別獲得了具有Km抗性的17個和7個株系，轉(zhuǎn)化率分別為6.58％和1.86％。通過生根檢測、GUS基因檢測、PCR擴增以及RT-PCR檢測等方法表明，IR