順鉑和慶大霉素對小鼠耳蝸毛細胞的毒性作用.pdf

1、目的：⑴探討順鉑不同給藥途徑對C57小鼠耳蝸毛細胞損傷的特點。⑵通過X連鎖凋亡蛋白抑制因子(XIAP)過度表達對慶大霉素耳毒性的拮抗作用闡明慶大霉素耳毒性與耳蝸毛細胞凋亡的關(guān)系。 方法：①鼠齡2月的成年C57BL/6J小鼠隨機分成5組：A組(n=6)耳蝸圓窗龕生理鹽水給藥5μl；B組(n=6)耳蝸圓窗龕順鉑給藥5μl(1mg/ml)；C組(n=6)經(jīng)鼓膜中耳腔順鉑一次性灌注0.1ml(1mg/ml)；D組(n=6)腹腔注射順鉑4

2、mg kg-1·d-1*4d；E組(n=8)腹腔一次性注射順鉑15mg/kg。應(yīng)用具有頻率特性的聽覺腦干誘發(fā)電位(ABR)和畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(DPOAE)檢測5組動物給藥前和給藥后10天的ABR反應(yīng)閾和畸變產(chǎn)物幅值(DP)，并以ABR反應(yīng)閾和DP幅值為指標(biāo)，評估各組動物各頻率聽覺靈敏度及耳蝸外毛細胞功能情況。所有動物在第二次測試ABR和DPOAE后處死，行耳蝸琥珀酸脫氫酶染色及耳蝸基底膜鋪片，觀察用藥后毛細胞的形態(tài)學(xué)變化并繪制耳蝸毛細胞

3、圖。②應(yīng)用耳蝸基底膜分離取材及耳蝸器官離體培養(yǎng)技術(shù)，取出生后2-3天的C57BL/6J小鼠耳蝸基底膜行離體耳蝸器官培養(yǎng)，經(jīng)培養(yǎng)過夜后用不同濃度的慶大霉素培養(yǎng)液與離體基底膜共培養(yǎng)24或48小時。與0.1mM慶大霉素培養(yǎng)液共培養(yǎng)的部分基底膜培養(yǎng)24小時后，應(yīng)用FAM-peptide-FMK標(biāo)記的Caspase-3，Caspase-8，或Caspase-9指示劑作用1小時。再應(yīng)用熒光標(biāo)記的Phalloidin對全部耳蝸基底膜毛細胞的纖毛和表皮

4、板進行染色。在熒光顯微鏡下定量觀察不同濃度慶大霉素對耳蝸毛細胞的損傷規(guī)律及caspases的表達情況。最后再利用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)對實驗所用小鼠進行鑒定，區(qū)分同源野生型(Wild type，WT)小鼠和帶有6-Myc標(biāo)記的XIAP專基因(TG)小鼠，并進行兩組間的比較。 結(jié)果：⑴全身應(yīng)用順鉑的動物，各頻率(2-32kHz) ABR反應(yīng)閾及DP幅值用藥前后無明顯變化(P>

5、0.05)，僅耳蝸基底膜鉤端毛細胞中等程度缺失；中耳腔及圓窗龕局部給藥導(dǎo)致從高頻到低頻的ABR反應(yīng)閾明顯升高和DP幅值明顯降低(P<0.05)，毛細胞出現(xiàn)損傷、脫落，其損傷從頂回到底回有逐漸加重的趨勢，外毛細胞較內(nèi)毛細胞損傷更加嚴重，聽功能的變化和耳蝸毛細胞病理損傷基本一致。⑵在離體培養(yǎng)條件下，過度表達的XIAP對耳蝸毛細胞存活無明顯影響，野生型對照組和轉(zhuǎn)基因型小鼠耳蝸毛細胞均生長良好，偶見內(nèi)外毛細胞散在性缺失。慶大霉素對耳蝸毛細胞的損

6、傷是劑量和時間依賴性的，隨著培養(yǎng)液中慶大霉素濃度的增加和共培養(yǎng)時間的延長，野生型和轉(zhuǎn)基因型小鼠耳蝸底回毛細胞缺失均逐漸向耳蝸項回擴展。慶大霉素與基底膜共培養(yǎng)24小時，轉(zhuǎn)基因型小鼠與野生型對照小鼠耳蝸毛細胞損傷相似。0.1mM慶大霉素未引起耳蝸毛細胞的明顯缺失；0.25mM慶大霉素主要損害耳蝸中底回的內(nèi)外毛細胞，可引起全耳蝸約50％的內(nèi)外毛細胞缺失；0.5mM慶大霉素可引起全耳蝸約70％的內(nèi)外毛細胞缺損；1mM慶大霉素造成超過90％的內(nèi)外

7、毛細胞破壞。慶大霉素與基底膜共培養(yǎng)48小時，0.1mM慶大霉素引起野生型小鼠耳蝸中回約30％的毛細胞缺失以及耳蝸底回約60％的毛細胞缺失，而轉(zhuǎn)基因型小鼠耳蝸中回毛細胞缺失約15％，耳蝸底回毛細胞缺失約30％，兩型小鼠毛細胞存活數(shù)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；0.2mM硫酸慶大霉素引起的野生型和轉(zhuǎn)基因型小鼠毛細胞損失相似，底回毛細胞缺失近100％，頂回毛細胞缺失約20％?；啄づc0.1mM慶大霉素共培養(yǎng)24小時主要引起Caspase

8、-3，9的表達，過度表達的XIAP對caspase-3，9的表達有抑制作用。 結(jié)論：①順鉑不同給藥途徑導(dǎo)致C57小鼠耳蝸毛細胞損傷的特點各不相同。根據(jù)損傷特點的不同，中耳腔和圓窗龕局部給藥途徑可以用來建立順鉑誘發(fā)小鼠耳聾模型，但中耳腔給藥由于容易破壞中耳結(jié)構(gòu)而損傷聽力，因此，在只關(guān)注內(nèi)耳形態(tài)學(xué)改變的實驗中可以作為備選。②慶大霉素通過caspase途徑參與了耳蝸毛細胞凋亡的損傷，過度表達的XIAP可以拮抗慶大霉素的耳毒性，從而對耳