β-gal基因在體外及大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)的研究.pdf

1、中國(guó)醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文βgal基因在體外及大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)的研究姓名：張紅霞申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師：任常山2000.2.18周齡的Wistar大鼠30只，雌性，體蘑200300克，均由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。2主要試劑：(1)纓腿培券試劑，RPMll640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基及馬血清均為熒國(guó)Gibco公司產(chǎn)品，胎牛血清及小牛斑漬均購(gòu)趣天津熾研艇，多聚賴氨駿為莢國(guó)Sigma公司產(chǎn)黯。(2)一gal組織化學(xué)染

2、色試劑盒為德國(guó)BoehjngerMannheim公司產(chǎn)晶。(3)ABC免疫綴化試騫l盒為美國(guó)Vectot公司產(chǎn)熬。3，艨粒、瘸毒和綱胞揀：(1)HSV1擴(kuò)增子質(zhì)粒HSV1，該質(zhì)粒含有三個(gè)遺傳成份：來(lái)自PBR322的序到，包括氨芐青霉素抗性基因蠡撙壚翻夫疑l予蕊DNA復(fù)越起娩點(diǎn)ColE1ori是pHSVlac在大腸桿菌中傳代必需的序列；來(lái)自HSV1的序列，包括ltSV—l復(fù)露l超始點(diǎn)Otis翱包裝序列“氌”，是pHSVlacDNA包裝殘病

3、毒顆粒所必需的序列；一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，包括HSV1IE基因啟動(dòng)的IE68，在英下游受其調(diào)控的插入序列Ecoti。LacZ基因數(shù)及S￥一40Poly矗序列。其中LacZ基因編碼13一半乳糖醬酶，該酶在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中研i存在，因此‘爵戳作為HSV1載體瘸毒轉(zhuǎn)染崤孚‘磁物細(xì)簏熬標(biāo)記基因。(2)輔助病毒HSV—l17tsK，該病毒為HSV1溫敏突變株，具有嚴(yán)格的生長(zhǎng)溢度限澍，其允許溫度為3l℃，而在37℃感染時(shí)減弱或失活。(3)Vero細(xì)胞株，是q

4、洲綠猴腎細(xì)胞株，為HSV1敏感細(xì)胞株。4主要儀器：二氧化談孵箱(舀本Yf泓TO公司)，超凈工作臺(tái)(蘇州蘇凈集團(tuán)公司)，微孔濾器(美國(guó)MILIPORE公司)，倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，深低溫冰箱(德國(guó)REVCO公司)，冰凍切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)組織切片機(jī)(美翻AO公司)。實(shí)驗(yàn)方法：(I)胎大鼠中樞神經(jīng)細(xì)胞的原代培養(yǎng)：選取18～20天的大鼠驅(qū)熙組織，進(jìn)毒亍中摳神經(jīng)纓胞的體鄉(xiāng)蜷莠，逯過(guò)形態(tài)學(xué)觀察及圖像分析測(cè)您，確定體外培養(yǎng)神

5、經(jīng)元的最佳生長(zhǎng)時(shí)期。(2)用運(yùn)組有LacZ基因的ItSV1載體感染體鄉(xiāng)培養(yǎng)故神經(jīng)元，墩多一gal組織純學(xué)染色檢測(cè)LacZ基因在神經(jīng)元中的表達(dá)情況。(3)將蘑組有LacZ基因的載體病毒經(jīng)大鼠舞糙貘醵嗅神經(jīng)寒攫接爨l(xiāng)，鬟一gal組織化學(xué)染色撿測(cè)LacZ基因在大鼠中樞神經(jīng)元中的表達(dá)情況，用ABC免疫化學(xué)法及HE染色分析實(shí)驗(yàn)縫大鬣免疫學(xué)和瘸理學(xué)的改交。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：(1)胎大鼠中樞神經(jīng)元在體外進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，lO—15天為緇飚生長(zhǎng)最佳時(shí)絮，此時(shí)遙合予將