重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子發(fā)酵工藝和液相色譜法對(duì)其復(fù)性并同時(shí)純化.pdf

1、本論文先對(duì)大腸桿菌(E.coli)表達(dá)的rhGM-CSF進(jìn)行了發(fā)酵工藝和放大工藝的研究和優(yōu)化，得到高表達(dá)、高產(chǎn)量的包涵體，然后分別用疏水色譜(HPHIC)、離子交換色譜(HPIEC)、排阻色譜(SEC)對(duì)rhGM-CSF進(jìn)行了復(fù)性并同時(shí)純化。全文包括以下五個(gè)部分： 1.介紹了蛋白質(zhì)復(fù)性的意義，對(duì)近年來發(fā)展起來的蛋白質(zhì)復(fù)性新方法進(jìn)行了系統(tǒng)地綜述。對(duì)rhGM-CSF的復(fù)性及分離純化研究進(jìn)展進(jìn)行了評(píng)述。 2.rhGM-CSF搖

2、瓶發(fā)酵工藝和放大工藝的研究通過搖瓶發(fā)酵對(duì)大腸桿菌DH5α/pDH生產(chǎn)rhGM-CSF的培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)維持時(shí)間、接種量等進(jìn)行了研究，選擇了較好的搖瓶培養(yǎng)條件。結(jié)果表明，大腸桿菌適宜在32℃進(jìn)行培養(yǎng)，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期升溫至42℃誘導(dǎo)4～5小時(shí)，可獲得較高的表達(dá)量rhGM-CSF。同時(shí)進(jìn)行了發(fā)酵工藝的放大研究。 3.HPHIC對(duì)rhGM-CSF復(fù)性并同時(shí)純化成功應(yīng)用高效疏水色譜(HPHIC)對(duì)E.coli表達(dá)的rhGM

3、-CSF進(jìn)行了復(fù)性和純化，研究了固定相、鹽種類、流動(dòng)相pH、流動(dòng)相中脲濃度，GSH/GSSG比例等因素對(duì)rhGM-CSF復(fù)性和純化的影響。在優(yōu)化條件下，經(jīng)一步HPHIC可以得到比活為1.58×107IU/mg，純度為95.7％，質(zhì)量回收率為56.8％的rhGM-CSF。 4.HPIEC對(duì)rhGM-CSF復(fù)性并同時(shí)純化采用HPIEC法成功對(duì)7.0mol/L鹽酸胍變性的rhGM-CSF進(jìn)行了復(fù)性并同時(shí)純化，考察了流動(dòng)相pH、流動(dòng)相中

4、脲濃度、GSH/GSSG比例等因素對(duì)rhGM-CSF復(fù)性的影響。結(jié)果表明，GSSG/GSH可有效提高rhGM-CSF二硫鍵的正確對(duì)接和復(fù)性效率，而低濃度的脲則可有效抑制蛋白沉淀，可大大提高質(zhì)量回收率。在最優(yōu)化條件下，HPIEC一步可使rhGM-CSF在分離純化的同時(shí)進(jìn)行復(fù)性，其比活為1.66×107IU/mg，質(zhì)量回收率為58.8％，純度可達(dá)到96.2％。 5.SEC對(duì)rhGM-CSF復(fù)性并同時(shí)純化應(yīng)用SEC法對(duì)rhGM-CSF