興安落葉松幾丁質酶基因的克隆及特性分析.pdf

1、興安落葉松（Larix gmelinii）主要分布于我國東北地區(qū)，是森林生態(tài)系統(tǒng)中的優(yōu)勢樹種，既能在高寒環(huán)境下生存，又能在復雜的逆境條件下正常生長，是研究植物抗逆基因的良好材料。幾丁質酶是一種植物抗逆相關蛋白，特別是在植物抵御病害及低溫的過程中發(fā)揮重要的作用，它具有熱滯活性，能夠降低冰點、抑制冰晶生長及重結晶，從而保護植物免受凍害。
　　本研究以分析幾丁質酶在興安落葉松抵御低溫中所發(fā)揮的作用，探討其在提高轉基因植物抗寒性中的可應用

2、性為目的，通過RT-PCR技術克隆得到了一個興安落葉松幾丁質酶基因，命名為LgChi2。LgChi2 cDNA全長包含一個831bp的開放閱讀框，編碼276個氨基酸，蛋白分子量為28.4kDa，理論等電點為7.83，DNA全長為1395bp，包含兩個內含子，三個外顯子。系統(tǒng)進化分析顯示，LgChi2與挪威云杉、花旗松、日本柳杉等植物的classⅣ幾丁酶基因具有極高的同源性。利用基因槍法轉化洋蔥表皮細胞對LgChi蛋白的亞細胞定位進行分析

3、的結果顯示，LgChi∷GFP融合蛋白定位于細胞邊緣。表達特性分析結果顯示，該基因主要表達在興安落葉松的幼莖中，在4℃低溫脅迫條件下，LgChi2的表達量明顯增加，顯示該基因為誘導型表達基因。同時，低溫脅迫條件下興安落葉松幾丁質酶的活性呈先升高后下降的趨勢，進一步顯示幾丁質酶基因在興安落葉松抵御低溫脅迫中發(fā)揮作用。
　　為進一步分析該基因在植物適應低溫脅迫中的應答機制，我們分別構建了真核的雙元表達載體pBI101-LgChi和原核

4、表達載體pET32a(+)-LgChi，并通過遺傳轉化的方法深入分析其在提高轉基因生物抗寒性中的作用。結果表明，pET32a(+)-LgChi重組菌經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，觀察到與預期大小一致的融合表達蛋白，同時，LgChi基因在大腸桿菌DE3中超表達，增強了細胞在低溫脅迫下的生長速度。低溫脅迫下，轉LgChi基因擬南芥和野生型擬南芥的三種抗氧化物酶即過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)和過氧化物酶(POD)的活性均增