宮頸柱狀上皮移位患者HSV-2的檢測及5-ALA-PDT體外抗HSV-2作用探討.pdf

1、生殖器皰疹是由單純皰疹病毒Ⅱ型(herpessimplexvirus-2HSV-2)，感染引起的常見病毒性性傳播疾病(SerxualtransmitteddiseaseSTD)，是STD門診生殖器潰瘍最主要的原因。HSV-2可以通過多種途徑感染宿主，而其中泌尿生殖道黏膜最易感染，主要表現(xiàn)為外生殖器簇集性小水皰、膿皰或糜爛、潰瘍。慢性宮頸炎是婦科常見病，臨床表現(xiàn)多為宮頸糜爛樣改變，其病因復雜。近年來的研究表明多種性傳播疾病與宮頸炎和宮頸癌

2、的發(fā)病密切相關(guān)。其中HSV-2感染具有反復發(fā)作的特點，其活動感染與宮頸柱狀上皮移位的產(chǎn)生相關(guān)性已逐漸引起了人們的重視。由于宮頸本身結(jié)構(gòu)特殊性，HSV-2感染宮頸后不易被確診，病毒反復發(fā)作使宮頸局部充血或潰瘍，又易合并其它感染，加速了局部的病理損害，使急性宮頸炎容易轉(zhuǎn)化為慢性宮頸炎，而宮頸糜爛樣改變程度不斷加重，形成惡性循環(huán)。HSV-2感染后病毒反復發(fā)作可刺激宮頸上皮非典型增生和鱗狀上皮化生，其與HPV協(xié)同引發(fā)宮頸癌發(fā)生也已引起越來越多的

3、關(guān)注。近年來生殖器皰疹合并宮頸柱狀上皮移位檢出率增多，國外在對宮頸分泌物檢查中發(fā)現(xiàn)HSV-2的感染率達32.9％。因此，在臨床上遇到宮頸柱狀上皮移位反復發(fā)作的患者，不可忽視對其進行單純皰疹病毒檢測。臨床上監(jiān)測HSV-2排泌的主要方法為病毒分離培養(yǎng)法和聚合酶鏈反應(yīng)（PolymerasechainreactionPCR）法，其中病毒培養(yǎng)法作為檢測HSV-2金標準，但該方法操作繁瑣，周期長，技術(shù)要求高，不易分型，而且檢測結(jié)果受轉(zhuǎn)運時間及轉(zhuǎn)運時

4、是否冷凍處理的影響很大，臨床常規(guī)應(yīng)用有很大的局限性。PCR法比病毒分離培養(yǎng)法敏感性高、需要時間短，具有特異、敏感、快速的特點，可大大提高診斷的準確性，并為臨床的早期診斷和治療提供重要依據(jù)，現(xiàn)己在臨床上逐漸使用。
　　 由于HSV-2感染具有潛伏性和反復發(fā)作的特點，一直都是臨床治療面臨的難點和研究方向，目前藥物治療、例如阿昔洛韋、伐昔洛韋，可用于縮短病程，減少復發(fā)次數(shù)，雖然目前抗病毒藥物在治療普通人群皰疹病毒感染上暫未見大量耐藥性

5、的報道，但對于免疫損害如HIV感染、器官移植患者抗病毒藥物抵抗己達到14％，且隨著醫(yī)學水平進步，器官移植患者增加，移植術(shù)后需服用藥物抑制排異反應(yīng)，此時患者免疫系統(tǒng)處于抑制狀態(tài)，使得HSV-2感染更易發(fā)作。此類患者皰疹感染常表現(xiàn)為頻繁復發(fā)，累及多個部位，病毒排放時間延長，病程長，一些病例累及多個內(nèi)臟器官。藥物的耐藥性對AIDS患者或者進行器官移植的皰疹患者治療產(chǎn)生新的問題。選擇有效、安全性好、可重復的治療方法，以達到控制病情、緩解患者痛苦

6、目的，為臨床上亟待解決的問題。
　　 光動力療法(Photodynamictherapy，PDT)是給予人體某種光敏劑，這些光敏劑可選擇性積聚于病變部位，經(jīng)與之相應(yīng)波長的激光照射后，光敏劑即產(chǎn)生游離的原子團、氧自由基，通過生物光敏化作用引起病變部位細胞損害，達到治療疾病的目的。是一種微侵襲性、能引起局部組織破壞的、非產(chǎn)熱性治療手段。隨著新型光敏劑的研究和對光動力學療法機制研究的不斷深入，光動力療法在皮膚科的適應(yīng)癥已經(jīng)從皮膚腫瘤拓

7、展到多種良性皮膚疾病的，如鮮紅斑痣、光線性角化病及痤瘡、銀屑病的治療，近年來的研究還嘗試將PDT用于病毒疾病的治療，光動力療法殺滅病毒的機制是卟啉類光敏劑與構(gòu)成病毒包膜整體部分的脂類和糖脂具有親和力，由于病毒的包膜來自于病毒寄生的細胞原生質(zhì)膜。所以被病毒感染的細胞胞膜和病毒包膜為光敏劑的結(jié)合部位。經(jīng)光敏化作用后，被病毒感染的細胞胞膜和病毒包膜的完整性被破壞。單純皰疹病毒是有包膜的病毒，光動力療法對其有直接滅活作用。光動力療法作用后病毒的

8、立早期基因ICP027、晚期基因VP16和gD的水平均下降，因此有專家推測光動力可通過干擾病毒復制所必須的基因的合成而抑制病毒的增殖。而正常組織中因為光敏劑的蓄積少，不引起光敏化作用，因此對正常組織細胞無影響。目前有研究報道表明采用證明光動力學療法對體外HSV-1有直接滅活作用，另有國外文獻報道采用光動力療法治療復發(fā)性口唇皰疹能減輕患者癥狀、降低復發(fā)次數(shù)。
　　 研究目的:
　　 生殖器皰疹的發(fā)病率高，對HSV-2感染的

9、早期診斷、進行治療有助于有效控制疾病傳播。本研究從檢測及治療方面入手，以期為臨床診斷及治療方面提供實驗室參考。
　　 研究內(nèi)容:
　　 1.采用實時定量PCR法對宮頸柱狀上皮移位患者宮頸棉拭子標本中HSV-2進行檢測，了解宮頸柱狀上皮移位患者HSV-2感染的情況，評估宮頸柱狀上皮移位和HSV-2感染之間的關(guān)系。
　　 2.以感染HSV-2333標準株的人角質(zhì)形成細胞(HumanKeratinocytesHaCat

10、)株為研究對象，通過加入一定濃度的光敏劑5-氨基酮戊酸(5-aminolexulinicacid5-ALA)及不同能量密度632nm波長半導體激光對體外HSV-2病毒進行處理，研究5-ALA-PDT對體外HSV-2的殺滅作用，為探討5-ALA-PDT治療生殖器皰疹的可行性提供初步實驗室依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.采用Real-timePCR法對皮膚科及婦產(chǎn)科門診262例患者取宮頸分泌物棉拭子標本進行檢測HSV-2，患

11、者均無生殖器皰疹病史，以宮頸炎、陰道分泌物異常就診患者。同時以87例宮頸光滑、外觀正常的同期健康體檢婦女為對照組，比較兩組HSV-2的感染情況及宮頸糜爛樣改變程度與HSV-2的關(guān)系。
　　 2.將體外培養(yǎng)的HaCat細胞分別加入不同濃度的5-ALA(0、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4mmol/L)孵育3h，予不同能量密度(0、6、9、12、15、18、21J/cm2)632nm波長激光照射，四唑鹽(MTT)比色

12、法測定細胞存活率。觀察不同藥物濃度及激光能量對角質(zhì)形成細胞的影響。選取對角質(zhì)形成細胞無影響的臨界濃度及激光能量，為探討5-ALA-PDT對HSV-2的作用做準備。
　　 3.(1)PDT對細胞外HSV-2的處理:已經(jīng)作用3h后的0.5mmol/l的ALA溶液和HSV-2病毒原液的混合液接種于細HaCat細胞胞上，予以不同能量密度(6、9、12、15J/cm2)激光照射。(2)PDT對細胞內(nèi)HSV-2病毒處理:將HaCat細胞接種

13、HSV-2病毒原液，出現(xiàn)CPE后予以不同能量密度(6、9、12、15J/cm2)激光照射。以上兩種情況照射2天后，MTT法測定各孔的OD值，計算細胞保護率。探討5-ALA-PDT對HSV-2的殺滅作用。
　　 結(jié)果:
　　 1.宮頸棉拭子標本HSV-2檢出率宮頸柱狀上皮移位患者262例，其HSV-2檢出率30.9％，正常對照組87例中HSV-2檢出率9.2％，兩組的差異有統(tǒng)計學意義(x2=16.21，P＜0.001)。宮

14、頸柱狀上皮移位患者宮頸分泌物HSV-2檢出率較宮頸正常高。
　　 2.宮頸糜爛樣改變程度與HSV-2檢出率的關(guān)系宮頸糜爛樣改變輕、中和重度患者中，HSV-2陽性率分別為17.0％、27.9％、47.7％。不同程度的宮頸糜爛樣改變患者之間其HSV-2檢出率有差異(Z=-4.395，p＜0.001)，重度宮頸糜爛樣改變患者的HSV-2檢出率最高。宮頸糜爛樣改變程度與HSV-2的陽性率呈正相關(guān)(rs=0.272,P＜0.050)，即隨

15、著宮頸糜爛樣改變程度增加，HSV-2陽性率也增加。
　　 3.采用光動力療法選擇不同藥物濃度及激光能量作用于HaCat時:5-ALA-PDT的濃度不同對HaCat細胞存活率的影響也不同(F=1178.32，p＜0.001)，除0mmol/l濃度組與0.25mmol/l濃度組間不存在統(tǒng)計學差異外，其他各組之間均存在統(tǒng)計學差異(p＜0.001);能量密度不同對HaCat細胞的影響也不同(F=1001.56，p＜0.001))，除18

16、J/CM2與21J/CM2間生存率無統(tǒng)計學差異外，其他各組間均存在統(tǒng)計學差異(p＜0.001)。濃度組和能量組間存在交互效應(yīng)(F=60.58，p＜0.001)。
　　 4.5-ALA-PDT作用于HSV-2(1)5-ALA-PDT對細胞外HSV-2的殺傷作用:各組間的存活率差異有統(tǒng)計學意義(F=79.38，p＜0.001);當5-ALA-PDT濃度在0.5mmol/l時，隨著能量密度的增大，細胞存活率逐漸增大。病毒對照組、0.5

17、mmol/(l).6J/CM2、0.5mmol/(l).9J/CM2與細胞對照組之間的差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.001);細胞對照組和能量組0.5mmol/(l).9J/cm2、0.5mmol/(l).12J/cm2、0.5mmol/(l).15J/cm2與病毒對照組之間的差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.001);(2)5-ALA-PDT對HaCat細胞內(nèi)HSV-2殺傷:各組間的存活率差異有統(tǒng)計學意義(F=17.01，p＜0.001)。當5

18、-ALA-PDT濃度在0.5mmol/l時，隨著能量密度的增大，細胞存活率逐漸增大。病毒組和0.5mmol/lALA.6J/cm2、0.5mmol/LALA.9J/cm20.5mmol/LALA.12J/cm2組細胞存活率與細胞對照組差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.001)，細胞對照組和能量組12J/cm2組、15J/cm2與病毒對照組存活率差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.001)。
　　 結(jié)論:
　　 1.宮頸柱狀上皮移位患者宮頸