神經(jīng)珠蛋白對心肌肥大、凋亡的影響及其機制的研究.pdf

1、背景:
　　神經(jīng)珠蛋白(neuroglobin，Ngb)又叫作腦紅蛋白，是一種主要表達于腦組織的攜氧球蛋白，能夠參與能量代謝、線粒體功能以及細胞生長和擴增的信號通路調(diào)節(jié)，并能維持神經(jīng)元細胞氧穩(wěn)態(tài)來應對氧化應激壓力。最近的研究表明Ngb在心肌細胞中也有較高的表達，然而其在心肌細胞中的具體作用機制仍然不是很清楚。本研究以大鼠H9c2成肌細胞為體外細胞模型和大鼠為動物模型，研究Ngb在心肌肥大及心肌細胞凋亡中的作用及其機制。
　　

2、目的:
　　1. 研究神經(jīng)珠蛋白對心肌肥大的影響;
　　2. 研究神經(jīng)珠蛋白對心肌細胞凋亡的影響;
　　3. 研究神經(jīng)珠蛋白調(diào)控心肌細胞凋亡的作用機制。
　　方法:
　　用含不同濃度的異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)(0 nM，10 nM，100 nM，500 nM，1μM)的培養(yǎng)基處理體外培養(yǎng)的大鼠H9c2成肌細胞12小時或者含有1μM異丙腎上腺素的培養(yǎng)基處理細胞0h，6h，12h，18

3、h，24 h，36h后，用倒置相差顯微鏡觀察H9c2成肌細胞的形態(tài)學變化;用MTT方法檢測不同條件處理細胞后細胞的存活率;用Caspase-3還原酶試劑盒檢測細胞酶活力變化情況，同時使用Western雜交檢測Ngb及凋亡相關蛋白的表達量以及在細胞中的亞定位;并利用流式細胞術測定活性氧變化;流式細胞術PI單染法檢測細胞周期以及Annexin v-FITC PI雙染法檢測凋亡細胞所占比例。最后，在H9c2成肌細胞上轉染Ngb基因片段（過表達

4、Ngb）或NgbshRNA（敲除Ngb），并觀察細胞形態(tài)學變化及對成肌細胞凋亡的影響并探討其作用機制。
　　結果
　　1. 心肌細胞的死亡率（壞死、凋亡）、肥大細胞比例，隨異丙腎上腺素藥物濃度以及作用時間的增加而增加，存活細胞的比例先減少后期則有所回升。在異丙腎上腺素藥物濃度為1μM和作用時間為12h時，心肌細胞的肥大比例和死亡率為最高。
　　2. HE染色和免疫組化技術檢測結果顯示，用異丙腎上腺素藥物處理后的大鼠心肌

5、細胞出現(xiàn)明顯的肥大，同時細胞中Ngb的表達顯著上升。
　　3. 流式細胞術Annexin v-FITC PI雙染法檢測細胞結果顯示細胞凋亡在Ngb降低表達的（shRNA）心肌細胞中最為明顯，而在過表達Ngb的心肌細胞中最不明顯。
　　4. Western Blotting及實時熒光定量PCR(Quantitative RT-PCR，qPCR)
　　檢測p53、Bax、PUMA、NOXA、DR5、Scotin、Bcl-2

6、表達情況，發(fā)現(xiàn)這些基因在Ngb降低表達的心肌細胞中的表達在蛋白和mRNA水平上顯著升高，但在過表達Ngb的心肌細胞中表達在蛋白和mRNA水平上都顯著降低，Bcl-2則相反。
　　5. 流式細胞術檢測H9c2成肌細胞中活性氧的含量情況，結果顯示其活性氧的含量在Ngb降低表達的心肌細胞中含量最高，但在過表達Ngb的細胞中含量最低。
　　6. 將細胞活性氧抑制劑(N-acetyl-cysteine，ROS scavengere，N

7、AC)與異丙腎上腺素藥物共同作用H9c2成肌細胞后與單獨加入異丙腎上腺素相比，可見細胞內(nèi)活性氧含量顯著下降，所有組的H9c2細胞凋亡都明顯減少，其相對數(shù)量與以上凋亡檢測結果一致。說明ROS參與了凋亡的發(fā)生，且Ngb的作用與NAC相似，具有抗氧化作用。
　　結論:
　　1. 神經(jīng)珠蛋白在大鼠心肌細胞中都有表達并能夠顯著抑制異丙腎上腺素誘導的心肌肥大。
　　2. 神經(jīng)珠蛋白能通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)活性氧含量和p53途徑抑制異丙腎上