主客體組裝構建新型刺激響應基因傳遞體系的研究.pdf

1、基因治療作為當今最活躍的生物技術之一，為許多嚴重疾病的治療帶來了新的希望。如何開發(fā)細胞外穩(wěn)定傳遞、細胞內(nèi)響應解離并高效轉染的基因傳遞體系是基因治療臨床應用的關鍵科學問題。同時隨著人類對生命質量的追求，人們對疾病的早期診斷提出了更高的要求，因此開發(fā)診斷兼治療的多功能納米傳遞體系具有非常重要的意義。本論文基于主客體作用構建了新型刺激響應的基因傳遞體系，初步探討了組裝體結構及功能模塊化設計與基因傳遞效率的內(nèi)在聯(lián)系。
　　細胞外穩(wěn)定傳遞和

2、細胞內(nèi)解離釋放是基因傳遞體系設計需要關注的一對矛盾。我們首先合成了不同β-環(huán)糊精(CD)接枝率的CD修飾聚乙烯亞胺(PEI-CD)，研究發(fā)現(xiàn)CD接枝率對聚陽離子締合特性產(chǎn)生很大影響，且CD接枝率為2.5％的PEI-CD15能夠有效締合DNA形成尺寸小于120 nm的納米粒子。人腎上皮細胞(HEK293T)培養(yǎng)結果表明:CD的修飾有利于小窩蛋白介導的細胞內(nèi)吞，從而提高了基因轉染效率。進一步合成了偶氮苯修飾聚乙二醇(Az-PEG)，依據(jù)環(huán)糊

3、精與偶氮苯的主客體作用，成功制備了尺寸約為110nm的PEI-CD15/Az-PEG/DNA超分子組裝體。PEG殼層的存在顯著降低了表面電位，使組裝體具有較好的生理鹽和抗聚陰離子穩(wěn)定性。凝膠電泳和表面電位測定結果表明采用365 nm長波紫外光照射15min后，超分子組裝體的PEG殼層可有效脫離。由于長波紫外光照對細胞存活率影響較小，進一步利用偶氮苯的光致異構特性實現(xiàn)了細胞內(nèi)PEG殼層的解組裝響應，有利于DNA的釋放并進攻細胞核，顯著提高

4、了基因轉染效率，為應用超分子組裝技術設計新型的刺激響應基因傳遞體系提供了嶄新的途徑。
　　具有診斷和治療功能的多功能納米粒子是當前發(fā)展的熱門領域，也是未來發(fā)展的趨勢。我們突破復雜的傳統(tǒng)化學制備法，采用模塊化組裝構建了具有靶向、顯像和響應性傳遞功能的多功能納米粒子。合成了CD修飾的聚乙烯亞胺(PEI-CD)作為骨架聚合物，選用異硫氰酸熒光素(FITC)和半乳糖(Gal)分別作為模型熒光探針和靶向分子，制備了FITC修飾金剛烷(AD-

5、FITC)及偶氮苯修飾半乳糖化聚乙二醇(Az-PEG-Gal)，基于CD/AD和CD/Az主客體作用成功構建了多功能超分子聚合物AD-FITC/PEI-CD/Az-PEG-Gal并命名為SPG-Gal。其能夠有效締合DNA形成尺寸小于100 nm，表面電位約為+6 mV的納米粒子，且具有較好的生理鹽和抗聚陰離子穩(wěn)定性。人肝癌細胞(HepG2)培養(yǎng)結果表明:熒光分子的引入賦予了SPG-Gal/DNA超分子組裝體細胞內(nèi)運轉示蹤功能;半乳糖的

6、靶向修飾顯著提高了HepG2細胞對多功能納米粒子的內(nèi)吞效率;偶氮苯的光致異構有利于PEG殼層脫卸和DNA進攻細胞核，進一步提高了基因表達水平。因此，基于主客體作用的模塊化組裝為構建具有靶向、顯像和響應傳遞功能的多功能納米粒子提供了有效的技術平臺。
　　上述體系中基于PEI改性基因載體由于具有不可生物降解、細胞毒性大等缺點，限制了其在臨床治療中的應用。多糖具有良好的生物相容性，在非病毒基因載體的設計中顯示出巨大的應用前景。本論文以多

7、糖葡聚糖作為骨架材料，選用具有穿膜能力的寡聚精氨酸R8作為陽離子肽，分別合成了R8修飾α-CD(CDR)、亞胺鍵共價鍵合的偶氮苯修飾葡聚糖(Az-I-Dex)，利用環(huán)糊精與偶氮苯的主客體相互作用，成功制備了葡聚糖基可脫卸基因傳遞體系CDR/Az-I-Dex/DNA。研究發(fā)現(xiàn)CD與Az的摩爾比C/A對組裝體粒徑有很大影響，當C/A比為0.4和0.7時能夠締合DNA形成小尺寸納米粒子。高分子量葡聚糖顯著提高了組裝體的生理鹽穩(wěn)定性，且亞胺鍵賦

8、予了組裝體pH-響應特性。采用HEK293T和Cos7細胞進行細胞學評價，結果表明:超分子聚合物CDR/Az-I-Dex在100μg/mL CDR時仍具有80％以上的細胞存活率，顯示出較好的生物相容性;穿膜多肽R8顯著提高了組裝體的內(nèi)吞效率;CDR/Az-I-Dex/DNA組裝體的轉染效率是CDR/DNA組裝體的6～300倍，與高分子量聚賴氨酸PLL水平相當。采用主客體作用和pH響應化學鍵相結合，構建了具有良好生物相容性的葡聚糖基基因傳