主客體組裝構(gòu)建新型刺激響應(yīng)基因傳遞體系的研究.pdf

1、基因治療作為當(dāng)今最活躍的生物技術(shù)之一，為許多嚴(yán)重疾病的治療帶來(lái)了新的希望。如何開發(fā)細(xì)胞外穩(wěn)定傳遞、細(xì)胞內(nèi)響應(yīng)解離并高效轉(zhuǎn)染的基因傳遞體系是基因治療臨床應(yīng)用的關(guān)鍵科學(xué)問題。同時(shí)隨著人類對(duì)生命質(zhì)量的追求，人們對(duì)疾病的早期診斷提出了更高的要求，因此開發(fā)診斷兼治療的多功能納米傳遞體系具有非常重要的意義。本論文基于主客體作用構(gòu)建了新型刺激響應(yīng)的基因傳遞體系，初步探討了組裝體結(jié)構(gòu)及功能模塊化設(shè)計(jì)與基因傳遞效率的內(nèi)在聯(lián)系。
　　細(xì)胞外穩(wěn)定傳遞和

2、細(xì)胞內(nèi)解離釋放是基因傳遞體系設(shè)計(jì)需要關(guān)注的一對(duì)矛盾。我們首先合成了不同β-環(huán)糊精(CD)接枝率的CD修飾聚乙烯亞胺(PEI-CD)，研究發(fā)現(xiàn)CD接枝率對(duì)聚陽(yáng)離子締合特性產(chǎn)生很大影響，且CD接枝率為2.5％的PEI-CD15能夠有效締合DNA形成尺寸小于120 nm的納米粒子。人腎上皮細(xì)胞(HEK293T)培養(yǎng)結(jié)果表明:CD的修飾有利于小窩蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞，從而提高了基因轉(zhuǎn)染效率。進(jìn)一步合成了偶氮苯修飾聚乙二醇(Az-PEG)，依據(jù)環(huán)糊

3、精與偶氮苯的主客體作用，成功制備了尺寸約為110nm的PEI-CD15/Az-PEG/DNA超分子組裝體。PEG殼層的存在顯著降低了表面電位，使組裝體具有較好的生理鹽和抗聚陰離子穩(wěn)定性。凝膠電泳和表面電位測(cè)定結(jié)果表明采用365 nm長(zhǎng)波紫外光照射15min后，超分子組裝體的PEG殼層可有效脫離。由于長(zhǎng)波紫外光照對(duì)細(xì)胞存活率影響較小，進(jìn)一步利用偶氮苯的光致異構(gòu)特性實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)PEG殼層的解組裝響應(yīng)，有利于DNA的釋放并進(jìn)攻細(xì)胞核，顯著提高

4、了基因轉(zhuǎn)染效率，為應(yīng)用超分子組裝技術(shù)設(shè)計(jì)新型的刺激響應(yīng)基因傳遞體系提供了嶄新的途徑。
　　具有診斷和治療功能的多功能納米粒子是當(dāng)前發(fā)展的熱門領(lǐng)域，也是未來(lái)發(fā)展的趨勢(shì)。我們突破復(fù)雜的傳統(tǒng)化學(xué)制備法，采用模塊化組裝構(gòu)建了具有靶向、顯像和響應(yīng)性傳遞功能的多功能納米粒子。合成了CD修飾的聚乙烯亞胺(PEI-CD)作為骨架聚合物，選用異硫氰酸熒光素(FITC)和半乳糖(Gal)分別作為模型熒光探針和靶向分子，制備了FITC修飾金剛烷(AD-

5、FITC)及偶氮苯修飾半乳糖化聚乙二醇(Az-PEG-Gal)，基于CD/AD和CD/Az主客體作用成功構(gòu)建了多功能超分子聚合物AD-FITC/PEI-CD/Az-PEG-Gal并命名為SPG-Gal。其能夠有效締合DNA形成尺寸小于100 nm，表面電位約為+6 mV的納米粒子，且具有較好的生理鹽和抗聚陰離子穩(wěn)定性。人肝癌細(xì)胞(HepG2)培養(yǎng)結(jié)果表明:熒光分子的引入賦予了SPG-Gal/DNA超分子組裝體細(xì)胞內(nèi)運(yùn)轉(zhuǎn)示蹤功能;半乳糖的

6、靶向修飾顯著提高了HepG2細(xì)胞對(duì)多功能納米粒子的內(nèi)吞效率;偶氮苯的光致異構(gòu)有利于PEG殼層脫卸和DNA進(jìn)攻細(xì)胞核，進(jìn)一步提高了基因表達(dá)水平。因此，基于主客體作用的模塊化組裝為構(gòu)建具有靶向、顯像和響應(yīng)傳遞功能的多功能納米粒子提供了有效的技術(shù)平臺(tái)。
　　上述體系中基于PEI改性基因載體由于具有不可生物降解、細(xì)胞毒性大等缺點(diǎn)，限制了其在臨床治療中的應(yīng)用。多糖具有良好的生物相容性，在非病毒基因載體的設(shè)計(jì)中顯示出巨大的應(yīng)用前景。本論文以多

7、糖葡聚糖作為骨架材料，選用具有穿膜能力的寡聚精氨酸R8作為陽(yáng)離子肽，分別合成了R8修飾α-CD(CDR)、亞胺鍵共價(jià)鍵合的偶氮苯修飾葡聚糖(Az-I-Dex)，利用環(huán)糊精與偶氮苯的主客體相互作用，成功制備了葡聚糖基可脫卸基因傳遞體系CDR/Az-I-Dex/DNA。研究發(fā)現(xiàn)CD與Az的摩爾比C/A對(duì)組裝體粒徑有很大影響，當(dāng)C/A比為0.4和0.7時(shí)能夠締合DNA形成小尺寸納米粒子。高分子量葡聚糖顯著提高了組裝體的生理鹽穩(wěn)定性，且亞胺鍵賦

8、予了組裝體pH-響應(yīng)特性。采用HEK293T和Cos7細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞學(xué)評(píng)價(jià)，結(jié)果表明:超分子聚合物CDR/Az-I-Dex在100μg/mL CDR時(shí)仍具有80％以上的細(xì)胞存活率，顯示出較好的生物相容性;穿膜多肽R8顯著提高了組裝體的內(nèi)吞效率;CDR/Az-I-Dex/DNA組裝體的轉(zhuǎn)染效率是CDR/DNA組裝體的6～300倍，與高分子量聚賴氨酸PLL水平相當(dāng)。采用主客體作用和pH響應(yīng)化學(xué)鍵相結(jié)合，構(gòu)建了具有良好生物相容性的葡聚糖基基因傳