MTA3過表達(dá)胃腺癌細(xì)胞株的建立及MTA3過表達(dá)對EMT的影響.pdf

1、目的：建立穩(wěn)定表達(dá)MTA3和luc2的胃癌細(xì)胞株SGC7901-pMTA3-IRES2-luc2；對比轉(zhuǎn)染MTA3對Snail、E-cadherin表達(dá)的變化，探討MTA3對胃腺癌EMT的影響。
　　方法：以pIRES2-EGFP作為模板，設(shè)計引物PCR擴增pIRES2片段，將pIRES2片段與luc2基因片段連接構(gòu)建 pIRES2-luc2，將 MTA3插入到 pIRES2-luc2中構(gòu)建pMTA3-IRES2-luc2共表達(dá)載

2、體，并通過單酶切、雙酶切、測序等方法對共表達(dá)載體進行鑒定；將共表達(dá)載體pMTA3-IRES2-luc2、pIRES2-luc2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞系SGC7901，通過G418耐藥篩選及有限稀釋法篩選高表達(dá)MTA3和luc2的克隆株，并進行擴大培養(yǎng)建立穩(wěn)定表達(dá)MTA3和luc2的細(xì)胞株SGC7901-pIRES2-luc2、SGC7901-pMTA3-IRES2-luc2。擴大培養(yǎng)后提取mRNA、蛋白質(zhì)，利用PCR、Western blo

3、t技術(shù)，鑒定2個細(xì)胞克隆株MTA3表達(dá)的差異；利用PCR、Western blot技術(shù)檢測Snail、E-cadherin表達(dá)，分析MTA3過表達(dá)對Snail、E-cadherin表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：酶切、測序等結(jié)果顯示pMTA3-IRES2-luc2、pIRES2-luc2共表達(dá)載體的鑒定與預(yù)期結(jié)果完全相符，共表達(dá)載體構(gòu)建成功，可用于后續(xù)實驗；利用 pMTA3-IRES2-luc2、pIRES2-luc2共表達(dá)載體質(zhì)粒對SG

4、C7901細(xì)胞系進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，成功建立了穩(wěn)定表達(dá)MTA3和luc2基因的細(xì)胞株SGC7901-pIRES2-luc2、SGC7901-pMTA3-IRES2-luc2；利用 PCR、Western blot等技術(shù)，鑒定2個細(xì)胞株中MTA3表達(dá)的差異，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pMTA3-IRES2-luc2組MTA3表達(dá)量明顯較對照組pIRES2-luc2組高，P值=0.000，有統(tǒng)計學(xué)意義，證明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系建立成功； PCR、Western blot