熒光定量PCR檢測(cè)脆弱類(lèi)桿菌的研究.pdf

1、目的： 脆弱類(lèi)桿菌(Bacteria~ragilis,Bf)是一種革蘭氏陰性無(wú)芽孢厭氧桿菌，為臨床上重要的條件致病菌，可引起多種感染性疾病。脆弱類(lèi)桿菌也是人體腸道正常菌群的優(yōu)勢(shì)菌，在維持腸道微生態(tài)平衡中起著重要的作用。傳統(tǒng)的脆弱類(lèi)桿菌定性定量檢測(cè)法主要是通過(guò)厭氧培養(yǎng)后進(jìn)行生化鑒定和平板計(jì)數(shù)，這種方法不但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且時(shí)常會(huì)引起鑒定、計(jì)數(shù)失誤。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外出現(xiàn)了以16SrRNA為靶設(shè)計(jì)引物，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)菌的報(bào)道。此法

2、具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)對(duì)熒光定量PCR在脆弱類(lèi)桿菌檢測(cè)中的應(yīng)用做初步的研究。 方法： 以脆弱類(lèi)桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC2528516SrRNA基因序列為靶，設(shè)計(jì)脆弱類(lèi)桿菌種特異性引物，分別以脆弱類(lèi)桿菌ATCC25285基因組DNA和目標(biāo)基因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)品，與已知DNA含量的12株脆弱類(lèi)桿菌、3株脆弱類(lèi)桿菌未定株(僅有1項(xiàng)生化反應(yīng)與脆弱類(lèi)桿菌不同)和其它7種細(xì)菌一起進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，對(duì)脆弱類(lèi)桿菌進(jìn)行鑒定

3、，并與生化鑒定法作比較。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)定量脆弱類(lèi)桿菌DNA的含量，并與實(shí)際DNA量做比較，研究熒光定量PCR定量的準(zhǔn)確性；對(duì)已知含量的脆弱類(lèi)桿菌DNA進(jìn)行10倍等比稀釋?zhuān)瑱z測(cè)熒光定量PCR的靈敏度。 結(jié)果： 1．熒光定量PCR不但能夠?qū)?2株脆弱類(lèi)桿菌鑒定出來(lái)，而且還可以把3株生化反應(yīng)不能夠確定的脆弱類(lèi)桿菌檢測(cè)出來(lái)。 2·兩種方法制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，其閾值循環(huán)數(shù)與模板濃度的對(duì)數(shù)值之間均具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。兩種標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)