腫瘤血管生成靶向超聲造影微泡的研制.pdf

1、肝硬化結(jié)節(jié)到肝細(xì)胞癌(HCC)演變的過(guò)程伴隨著腫瘤血管生成，檢測(cè)新生血管對(duì)早期診斷HCC有重要意義。對(duì)于血管內(nèi)皮細(xì)胞因子誘導(dǎo)階段的變化，目前的常規(guī)影像技術(shù)無(wú)法企及。而分子影像學(xué)可在活體狀態(tài)從分子和細(xì)胞水平進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，特異性顯影高表達(dá)的腫瘤血管因子類(lèi)受體，達(dá)到HCC的早期診斷。靶向超聲造影(TCEUS)是超聲領(lǐng)域的分子影像學(xué)技術(shù)。TCEUS通過(guò)分子探針即靶向微泡(MBt)表面的特異性抗體與靶區(qū)新生血管的抗原發(fā)生反應(yīng)，采用超聲檢測(cè)靶

2、區(qū)積聚的MBt信號(hào)，分析相應(yīng)分子的表達(dá)量。有關(guān)腫瘤血管生成的TCEUS研究尚屬于初步的探索階段。MBt的研制是TCEUS的核心技術(shù)。 目的： 研發(fā)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞靶向微泡(αvβ3-MBt)，為建立TCEUS檢測(cè)腫瘤血管生成的技術(shù)、開(kāi)發(fā)一種非侵襲性早期診斷肝硬化結(jié)節(jié)癌變的臨床手段奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 材料和方法： 1.以合成磷脂為膜成份，六氟化硫?yàn)闅怏w核心，薄膜-超聲法制備普通脂質(zhì)微泡。與商業(yè)成品六氟化硫脂質(zhì)微

3、泡(SonoVue)作對(duì)照，觀測(cè)微泡理化特性、體外水囊及兔腎實(shí)質(zhì)的顯像效果。 2.以自制脂質(zhì)微泡為本體，薄膜-超聲法制備生物素化微泡(MBB)并與生物素抗體偶聯(lián)成為非特異性MBt。與普通微泡(MBn)作對(duì)照，觀測(cè)MBt物理特性。體外熒光驗(yàn)證“生物素-親和素-生物素”的夾層結(jié)構(gòu)。 3.薄膜—超聲法研制血管內(nèi)皮細(xì)胞靶向的αvβ3-MBt并熒光鑒定；人臍血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)分離、培養(yǎng)和鑒定；采用體外模擬系統(tǒng)平行平板流動(dòng)腔

4、(PPFC)驗(yàn)證αvβ3-MBt靶向HUVEC的能力。 結(jié)果： 1.自制微泡和SonoVue大小均勻，圓形，中空透亮，平均直徑分別為2.3μm和2.5μm，粒徑分布分別為0.4～10.0μm和0.2～10.0μm，90％微泡直徑分別控制在6.0μm和8.0μm以?xún)?nèi)，初始濃度分別為5.0～10.0×108/ml和1.0～5.0×108/ml，配置后的穩(wěn)定性均為6h。顯影水囊灰度值分別為121.7±6.8和122.3±4.5

5、(P>0.05)，兔腎造影增強(qiáng)峰灰度分別為72.0±7.2和74.7±11.0(P>0.05)。 2.非特異性MBt和MBn平均直徑分別為2.1μm±0.1μm和2.0μm±0.1μm(P>0.05)，2小時(shí)內(nèi)濃度曲線(xiàn)下降平緩，終濃度均>107/ml。MBn無(wú)熒光，MBB+熒光標(biāo)記親和素可見(jiàn)明亮綠色熒光；MBB+熒光標(biāo)記蛋白A無(wú)熒光顯示。MBB—SA分別加入熒光標(biāo)記的生物素或蛋白A后，前者可見(jiàn)明亮熒光，后者無(wú)熒光顯示。

6、3.αvβ3-MBt可見(jiàn)明亮綠色熒光，MBn未見(jiàn)熒光。原代HUVEC鑒定CD31和αvβ3，可見(jiàn)細(xì)胞膜明亮綠色熒光，兩抗原表達(dá)率分別為99.8％和98.4％。PPFC內(nèi)微泡結(jié)合實(shí)驗(yàn)，剪切力為0.5dynes/c㎡時(shí)，平均每個(gè)HUVEC結(jié)合αvβ3-MBt數(shù)為9.9±3.1，MBn為0.8±0.3(P<0.05)。 結(jié)論： 1.成功制備了普通脂質(zhì)微泡，經(jīng)檢驗(yàn)理化特性及顯影效果良好，與商業(yè)成品的脂質(zhì)微泡無(wú)差異。 2.