抗基孔肯亞病毒單克隆抗體人源化及真核細(xì)胞高效表達(dá)研究.pdf

1、該研究選擇在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(chinese hamster ovary,CHO)細(xì)胞中表達(dá)具有中和活性的抗基孔肯亞(chikungunya,Chik)病毒的嵌合抗體,以圖為Chik病的治療提供被動(dòng)免疫制劑.為表達(dá)嵌合抗體,首先克隆具有中和活性的抗Chik病毒的鼠源單克隆抗體(monoclonal antibody,McAb)V<,L>和V<,H>基因及人IgGl亞類(lèi)的C<,H>和C<,K>基因,通過(guò)融合PCR構(gòu)建了抗Chik病毒的完整人-

2、鼠嵌合抗體基因.將人-鼠嵌合抗體基因克隆到表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)(mutiple cloning site,MCS),構(gòu)建了恒定區(qū)(constant region,C區(qū))為cDNA序列的表達(dá)質(zhì)粒.將構(gòu)建的嵌合抗體表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO/dhfr<'->細(xì)胞,經(jīng)氨甲喋呤(methotrexate,MTX)加壓篩選,獲得最高表達(dá)量為2μg/ml的細(xì)胞株.對(duì)此細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)并純化抗Chik病毒的嵌合抗體.純化的嵌合抗體在非還原SDS-PAGE中表現(xiàn)

3、為一條約150kD的帶,在還原SDS-PAGE中表現(xiàn)為一條約50kD和一條約25kD的帶;Western印跡結(jié)果顯示,全分子蛋白和重鏈(heavy chain,H鏈)分子均可與羊抗人IgG Fc發(fā)生特異性免疫反應(yīng);全分子蛋白和輕鏈(light chain,L鏈)分子均可與羊抗人Kappa發(fā)生特異性免疫反應(yīng).用間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)(indirect immunofloresence assay,IFA)檢測(cè)顯示,純化的嵌合抗體與Chik病毒抗

4、原發(fā)生強(qiáng)反應(yīng),說(shuō)明表達(dá)的嵌合抗體保留了親本鼠源McAb的抗原結(jié)合活性.用不同濃度的純化嵌合抗體和鼠源McAb進(jìn)行微量細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn),結(jié)果25μg/ml的嵌合抗體和15μg/ml的鼠源McAb可以保護(hù)細(xì)胞不出現(xiàn)病變,說(shuō)明嵌合抗體具有與鼠源McAb相同的生物學(xué)活性.為了提高嵌合抗體的表達(dá)量,我們嘗試用Flp-In<'TM>系統(tǒng)表達(dá)嵌合抗體,獲得表達(dá)量為1μg/ml的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株.遺憾的是此系統(tǒng)不能進(jìn)行基因擴(kuò)增,基于此,我們構(gòu)建了在染色體的轉(zhuǎn)

5、錄活性位點(diǎn)整合了FRT序列的CHO/dhfr<'->細(xì)胞株,命名為CHO/dhfr<'->FRT<'+>.在此細(xì)胞株中,表達(dá)了抗Chik病毒的嵌合抗體,通過(guò)MTX加壓篩選,獲得表達(dá)量為5μg/ml的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株,是Flp-In<'TM>表達(dá)系統(tǒng)的5倍,是CHO/dhfr<'->表達(dá)系統(tǒng)的2.5倍.有報(bào)道稱(chēng),C<,K>基因組序列能改善抗體在CHO細(xì)胞中的表達(dá).但未見(jiàn)C<,H>基因組序列是否較cDNA序列表達(dá)量高的報(bào)道.因此克隆人抗體分子