轉(zhuǎn)基因腦腫瘤模型鼠腦腫瘤干細胞和神經(jīng)干細胞的比較研究.pdf

1、目的：通過Tet-on調(diào)控系統(tǒng)同時誘導表達c-myc、SV40Tag基因,建立更加穩(wěn)定的具有干細胞特性的可調(diào)控的腦腫瘤小鼠模型,對腦腫瘤干細胞和神經(jīng)干細胞進行比較研究,旨在為腦腫瘤發(fā)病機制的深入研究提供有意義的實驗資料。從該模型小鼠誘導前后的室管膜下區(qū)及腫瘤組織中,分別分離鑒定正常神經(jīng)干細胞(neural stem cells,NSCs)、誘導后神經(jīng)干細胞(NSC's)和腫瘤干細胞(brain tumorstem cells,BTSCs

2、)。通過三者的比較研究了解三者的異同點,確定存在差異的分子機制,為腦腫瘤干細胞起源于神經(jīng)干細胞的假說提供更多依據(jù)。
　　 方法：將pTRE2-C-myc轉(zhuǎn)基因小鼠與Tet-on、pTRE2-SV40Tag轉(zhuǎn)基因小鼠進行交配,將子代中同時表達pTRE2-c-myc、Tet-on和pTRE2-SV40Tag的轉(zhuǎn)基因小鼠,進行強力霉素(四環(huán)素類)誘導,觀察腦腫瘤的發(fā)生。通過磁共振成像、大體標本、組織切片、免疫組化對模型鼠腦腫瘤的特征進

3、行研究。從未經(jīng)強力霉素誘導的Tet-on轉(zhuǎn)基因成年小鼠以及誘導發(fā)生腦腫瘤的轉(zhuǎn)基因成體小鼠室管膜下區(qū)取材,制成單細胞懸液,培養(yǎng)于無血清干細胞培養(yǎng)基(DMEM/F12,添加bFGF、EGF和B27)以及含血清分化培養(yǎng)基(DMEM+10％FCS)。從出現(xiàn)臨床癥狀的轉(zhuǎn)基因小鼠松果體區(qū)肉眼可見的腫瘤組織中取材,制成單細胞懸液,培養(yǎng)于含生長因子的無血清培養(yǎng)基和含血清培養(yǎng)基。用相差顯微鏡觀察正常神經(jīng)干細胞球體,誘導后神經(jīng)干細胞球體和腫瘤干細胞球體及其

4、分化細胞形態(tài),細胞增殖情況,電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu),用流式細胞儀檢測三組細胞中Hoechst33342陰性的SP(side population)細胞,細胞周期和染色體倍體。通過免疫熒光,檢測球體及其分化細胞中的nestin、NSE、GFAP、MAP2表達情況。通過免疫熒光,比較腦腫瘤干細胞和誘導前后神經(jīng)干細胞p53,c-myc通路的表達差異。
　　 結(jié)果：⑴73只同時表達pTRE2-c-myc、Tet-on和pTRE2-SV40T

5、ag的轉(zhuǎn)基因小鼠,經(jīng)過強力霉素誘導后,30只小鼠發(fā)生腦腫瘤,發(fā)生率為41.1％。除1例腦干腫瘤外,均位于松果體區(qū),誘導后到發(fā)生腦腫瘤的時間最長184d,最短為64d,平均為95d。腫瘤在T1加權(quán)像表現(xiàn)為等信號或稍高信號,在T2加權(quán)像表現(xiàn)為等信號或稍低信號,增強后可表現(xiàn)為均一強化或不均一強化。病理論斷為未分化成神經(jīng)管細胞瘤,腫瘤具有高侵襲性。免疫組化顯示,腫瘤高表達c-myc、SV40Tag和干/祖細胞標志物nestin。⑵未誘導成體轉(zhuǎn)基

6、因小鼠和誘導發(fā)生腦腫瘤的成體小鼠室管膜下區(qū)細胞,在無血清培養(yǎng)條件下,均呈懸浮的球狀生長。未誘導神經(jīng)干細胞(NSCs)球體,在含血清培養(yǎng)條件下,貼壁并分化為膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元。誘導后的神經(jīng)干細胞(NSC’s)球體,則表現(xiàn)為增殖活性增加和分化抑制。電鏡可見核質(zhì)比高、細胞器不發(fā)達,具干細胞特征的細胞。誘導后神經(jīng)干細胞與誘導前相比,細胞分化以及降解有關(guān)的細胞器(如溶酶體等)、自噬小體顯著減少。流式細胞儀檢測誘導前后的神經(jīng)干細胞球中的SP細胞,分別

7、為10.43％、16.89％,所有細胞均為二倍體,大部分細胞位于G0/G1期。免疫熒光顯示,未誘導神經(jīng)干細胞球體大部分細胞表達nestin,分化細胞分別表達GFAP和MAP2。誘導后的神經(jīng)干細胞球體中,大部分細胞表達nestin,少部分表達分化標志物GFAP、NSE,而部分分化細胞仍然共表達干細胞標志物nestin和分化標志物GFAP和MAP2,甚至同時表達兩種分化標志物GFAP和MAP2。⑶腫瘤細胞在無血清培養(yǎng)條件下,呈懸浮的球狀生長

8、,在含血清培養(yǎng)條件下貼壁并分化為瘤性膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元。電鏡下見到核質(zhì)比高、細胞器不發(fā)達、與細胞分化降解有關(guān)的細胞器罕見。流式細胞儀檢測腫瘤細胞球中的SP細胞為17.27％,異倍體細胞為26.77％,大部分細胞處于S期。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn),細胞球中大部分細胞表達干細胞標志物nestin,少數(shù)細胞表達分化標志物GFAP和NSE。貼壁細胞大部分仍然共表達干細胞標志物nestin和分化標志物GFAP和MAP2,甚至同時表達兩種分化標志物GFAP和

9、MAP2。腦腫瘤干細胞和誘導后,神經(jīng)干細胞高表達c-myc,MDM2(p53抑制基因)。
　　 結(jié)論：①成功建立更加穩(wěn)定的、可調(diào)控的、具有干細胞特性的腦腫瘤小鼠模型,為進一步研究腦腫瘤干細胞的特性奠定基礎。②成功從誘導前后的Tet-on轉(zhuǎn)基因成體小鼠室管膜下區(qū)中,分離到神經(jīng)干細胞,且發(fā)現(xiàn)誘導后的神經(jīng)干細胞表現(xiàn)為增殖活性增加和分化抑制,表明神經(jīng)干細胞已經(jīng)出現(xiàn)早期惡性轉(zhuǎn)化表現(xiàn)。③Tet-on轉(zhuǎn)基因小鼠腦腫瘤組織中,存在具有自我更新和