超聲造影劑聯(lián)合超聲輻照介導hsv1-tk轉染視網(wǎng)膜母細胞的實驗研究.pdf

1、第一章聲諾維聯(lián)合超聲輻照HXO-44Rb細胞的安全條件
　　目的：探索超聲造影劑聲諾維(SonoVue)聯(lián)合超聲輻照HXO-44Rb細胞的安全條件。
　　方法：將培養(yǎng)好的HXO-44Rb細胞以1×105個/孔接種到24孔細胞培養(yǎng)板上，設置4組：第1組：空白對照組（HXO-44Rb細胞）；第2組：細胞+聲諾維（造影劑濃度10％、20%）；第3組：細胞+超聲輻照（輻照方案：輻照時間40 s、60 s、80 s，輻照聲強0.5 w

2、/cm2、1.0 w/cm2、1.5 w/cm2、2.0 w/cm2）；第4組：細胞+超聲輻照+聲諾維組（輻照方案：輻照時間40 s、60 s、80 s，輻照聲強0.5 w/cm2、1.0 w/cm2、1.5 w/cm2、2.0 w/cm2，造影劑濃度10%、20%）。以上各組每組設置3個復孔。分別于輻照2h、24h、48 h后光鏡下觀察細胞的形態(tài)及生長情況，四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法（MTT）檢測細胞存活情況。
　　結果：在

3、輻照時間為40 s、60 s、80 s，輻照聲強為0.5 w/cm2、1.0 w/cm2、1.5 w/cm2，造影劑濃度為10%、20%的情況下，在各個時間點觀察時，腫瘤細胞的外形維持球形，均未發(fā)生明顯改變，仍呈片狀、團狀聚集生長，MTT法檢測細胞存活率最低（98.40±0.21）%，各組間差異無顯著性(P>0.05)；輻照時間為40 s、60 s、80 s，輻照聲強為2.0 w/cm2，造影劑濃度為10%、20%的情況下，腫瘤細胞外形

4、腫脹，培養(yǎng)基中可見細胞碎片，細胞間隙較其他組分散，MTT法檢測到細胞的存活率為（89.12±0.97）%，較其它組明顯降低(P<0.05)。
　　結論：HXO-44Rb細胞在輻照時間為40 s、60 s、80 s，輻照聲強為0.5 w/cm2、1.0 w/cm2、1.5 w/cm2，造影劑濃度為10%、20%條件下，各組細胞活性無明顯抑制；輻照時間為40 s、60 s、80 s，輻照聲強為2.0 w/cm2，造影劑濃度為10%、2

5、0%的情況下，MTT法檢測細胞的存活率為（89.12±0.97）%，較其它組明顯降低。
　　第二章 UTMD介導載hsv1-tk-gfp質粒轉染HXO-44Rb細胞實驗條件的優(yōu)化及結果評價
　　目的：探討超聲造影劑聲諾維(SonoVue)聯(lián)合超聲輻照介導載hsv1-tk-gfp質粒轉染HXO-44Rb細胞的可行性；對比不同輻照條件及造影劑濃度下介導hsv1-tk-gfp質粒轉染HXO-44Rb腫瘤細胞效率的差異，探索最佳轉染

6、條件。
　　方法：將培養(yǎng)好的HXO-44Rb細胞以1×105個/孔接種到24孔細胞培養(yǎng)板上，設置5組：第1組：空白對照組（HXO-44Rb細胞）；第2組：細胞+質粒；第3組：細胞+質粒+超聲輻照（輻照時間：40 s、60 s、80 s，輻照聲強：0.5 w/cm2、1.0 w/cm2、1.5 w/cm2）；第4組：細胞+質粒+聲諾維（造影劑濃度：10%、20%）；第5組：細胞+質粒+超聲輻照+聲諾維（輻照時間：40 s、60 s、

7、80 s，輻照聲強：0.5 w/cm2、1.0 w/cm2、1.5 w/cm2，造影劑濃度：10%、20%）。每組共3個復孔，質粒用量均為1μl/孔。轉染24h,48h后于倒置熒光鏡下觀察綠色熒光分布情況；轉染48 h后用流式細胞儀檢測各組hsv1-tk-gfp質粒轉染率，MTT檢測細胞存活情況。
　　結果：各組中：第4組中條件：輻照聲強為0.5 w/cm2、1.0 w/cm2、1.5w/cm2對應的轉染率分別為（3.82±1.0

8、3）%、（6.53±1.07）%,輻照條件為輻照時間60 s、輻照聲強1.5 w/cm2、造影劑濃度為20%下質粒的轉染率最高（14.07±0.21）%，明顯高于其它各組，差異具有顯著性（P<0.05）；MTT法檢測各組間細胞存活率在（98.40±0.21）%～（98.47±0.27）%之間，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　結論：輻照時間為60 s、輻照聲強為1.5 w/cm2、造影劑濃度為20%的條件下hsv1-tk-g

9、fp質粒轉染率最高。
　　第三章 hsv1-tk/GCV自殺基因系統(tǒng)對HXO-44Rb細胞殺傷作用及效果評價
　　目的：檢測聲造影劑聲諾維(SonoVue)聯(lián)合超聲輻照介導載hsv1-tk-gfp質粒轉染HXO-44Rb細胞后hsv1-tk/GCV自殺基因系統(tǒng)誘導HXO-44Rb腫瘤細胞凋亡的能力。
　　方法：將培養(yǎng)好的HXO-44Rb細胞以1×105個/孔接種到24孔細胞培養(yǎng)板上，設置3組：第1組：空白對照組（HXO

10、-44Rb）；第2組：細胞+昔洛韋（昔洛韋濃度：1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、1 mg/ml）；第3組：細胞+質粒+超聲輻照+聲諾維+昔洛韋（輻照時間：40 s、60 s、80 s，輻照聲強：0.5 w/cm2、1.0 w/cm2、1.5 w/cm2，造影劑濃度：10%、20%；昔洛韋濃度：1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、1 mg/ml）。細胞數(shù)量均為1×105個/孔，質粒用量均為1μl/孔。轉染48h

11、后倒置熒光鏡下觀察細胞存活情況，轉染48 h后MTT法檢測細胞的存活率。
　　結果：各組加入昔洛韋濃度為1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml時，細胞的存活率未見明顯降低；加入1 mg/ml的昔洛韋后，輻照聲強為0.5 w/cm2、1.0 w/cm2，HXO-44Rb細胞的存活率分別為（95.29±0.94）%、（92.58±1.29）%；在1.5 w/cm2、60 s、20%的條件下（55.26±1.21）%，較前兩組條